Tradisjonelle diagnostiske strategier for å oppdage infeksjonssykdommer krever bruk av benchtop-instrumenter som ikke er egnet for point-of-care testing (POCT).Emerging microfluidics er en svært miniatyrisert, automatisert og integrert teknologi som er et potensielt alternativ til tradisjonelle metoder for rask, rimelig, nøyaktig diagnostikk på stedet.Molekylær diagnostiske metoder er mye brukt i mikrofluidiske enheter som de mest effektive metodene for patogendeteksjon.Denne gjennomgangen oppsummerer nylige fremskritt innen mikrofluidbasert molekylær diagnostikk av infeksjonssykdommer fra både et akademisk og industrielt perspektiv.Først beskriver vi en typisk prosessering på brikken av nukleinsyrer, inkludert prøveforbehandling, amplifikasjon og signallesing.Deretter sammenlignes egenskapene, fordelene og ulempene ved de fire typene mikrofluidiske plattformer.Deretter vil vi diskutere bruken av digitale analyser for absolutt kvantifisering av nukleinsyrer.Både klassiske og nyere kommersielle mikrofluidbaserte molekylærdiagnostiske enheter er oppsummert som bevis på den nåværende markedstilstanden.Til slutt foreslår vi fremtidige retninger for mikrofluidisk diagnose av infeksjonssykdommer.
Smittsomme sykdommer er forårsaket av patogener, inkludert bakterier, virus og parasitter, som er distribuert over hele verden.I motsetning til andre sykdommer, blir patogener raskt infisert og spres mellom mennesker og vertsdyr gjennom inokulering, luft- og vannmedier [1].Forebygging av infeksjonssykdommer er kritisk som et folkehelsetiltak.Tre hovedstrategier for å bekjempe smittsomme sykdommer: (1) kontrollere smittekilden;(2) avbrudd av overføringsveien;(3) beskyttelse av mottakelige populasjoner.Blant hovedstrategiene regnes kontroll av infeksjonskilden som den viktigste strategien på grunn av dens bekvemmelighet og lave kostnader.Rask diagnose, isolasjon og behandling av infiserte individer er kritiske, og krever raske, sensitive og nøyaktige diagnostiske strategier [2].Dagens diagnose av infeksjonssykdommer kombinerer vanligvis klinisk undersøkelse basert på tegn og symptomer og laboratoriestudier som cellekultur og molekylær diagnostikk, som krever opplært personell, arbeidskrevende prosedyrer og dyrt testutstyr [3, 4].Forebygging av utbrudd av infeksjonssykdommer krever rask, rimelig og nøyaktig lokal diagnose, spesielt i ressursbegrensede områder hvor infeksjonssykdommer er vanlige og alvorlige [5], samt behandling i villmarken eller på slagmarken, hvor nødsituasjoner er uforutsigbare..medisinsk behandling er begrenset [6].I denne sammenhengen er mikrofluidikk en teknologi som kombinerer mikroelektromekaniske systemteknologier, nanoteknologi eller materialvitenskap for presis væskemanipulering [7,8,9,10], og gir nye muligheter for punkt-of-care-deteksjon (POCT).) smittestoffer utenfor sykehus og laboratorier.Sammenlignet med tradisjonell tidkrevende diagnostikk, tilbyr mikrofluidisk teknologi prøve- og kostnadsbesparelser for molekylær diagnostikk under sykdomsutbrudd.Den globale spredningen av koronavirussykdom 2019 (COVID-19) er forårsaket av alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2), så viktigheten av mikrofluidikk for rettidig forebygging og kontroll av pandemien blir igjen understreket [11, 12 , 1. 3].I motsetning til tradisjonell diagnostikk, bruker mikrofluidisk POCT små bærbare enheter som spenner fra benchtopanalysatorer til små sidestrømsteststrimler for å teste nær prøvetakingspunktet [14].Disse testene har forenklet eller ingen prøveforberedelse, rask signalforsterkning og sensitive signalavlesninger som resulterer i kort varighet og nøyaktige resultater innen minutter.Tilgjengeligheten og masseproduksjonen av mikrofluidbaserte helseinstrumenter har utvidet deres kostnadseffektive og direkte diagnostiske applikasjoner utenfor sykehuset, i nærheten av pasienten og til og med hjemme.
Blant de eksisterende strategiene for diagnostisering av infeksjonssykdommer er molekylær diagnostikk en av de mest sensitive [15, 16].I tillegg blir molekylær diagnostikk ofte brukt som gullstandarden for kontinuerlig påvisning av COVID-19, noe som tillater direkte påvisning av virusspesifikke områder av RNA eller DNA før utbruddet av en immunrespons [17, 18].I den nåværende gjennomgangen presenterer vi de siste fremskrittene innen mikrofluidikkbaserte molekylære diagnostiske prosesser for infeksjonssykdommer, fra et akademisk perspektiv til fremtidige industrielle perspektiver (fig. 1).Vi starter med tre nøkkeltrinn i nukleinsyredeteksjon: prøveforbehandling på brikken, nukleinsyreamplifisering og signallesing.Vi sammenlignet deretter ulike typer mikrofluidiske plattformer med deres struktur og funksjon, og viste unike egenskaper (styrker og svakheter).Digital nukleinsyredeteksjon er videre diskutert og gitt som et eksempel på en tredje generasjons teknologi for absolutt kvantifisering av infeksiøse patogenmolekyler.I tillegg vil flere typiske og nyeste kommersielle POCT-enheter bli presentert for å demonstrere den nåværende tilstanden til det mikrofluidiske POCT-markedet for molekylær diagnostikk.Vi vil også diskutere og forklare vår visjon for fremtidige søknader.
Moduler av mikrofluidchips for nukleinsyredeteksjon kan deles inn i tre kategorier (prøvetaking, gjenkjenning og signalering) i henhold til deres funksjoner [19].Blant disse modulene realiserer prøvetakingsmodulen hovedsakelig prøvelysis og nukleinsyreekstraksjon.Sensormodulen kontrollerer hovedsakelig konvertering og forsterkning av nukleinsyresignaler.Signaleringsmodulen oppdager signalet som konverteres og behandles av sensormodulen.Basert på prosessen med å detektere nukleinsyrer på en brikke, vil vi oppsummere de ulike brikkene som kan realisere funksjonen "inngang og utgang".
Det første trinnet i nukleinsyredeteksjon er nukleinsyreekstraksjon, dvs. å isolere målnukleinsyren fra den opprinnelige prøven.Nukleinsyreekstraksjon utføres for å rense nukleinsyrer fra andre molekylære forurensninger, sikre integriteten til den primære strukturen til nukleinsyremolekyler og optimalisere resultatene.Nukleinsyreekstraksjon krever nødvendig prøvelysering og nukleinsyrefangst, hvis kvalitet og effektivitet har stor innvirkning på forskning og diagnostiske resultater.Eventuelle subtile bivirkninger under ekstraksjon kan begrense ytterligere deteksjon.For eksempel hemmes metoder for polymerasekjedereaksjon (PCR) og loop isotermisk amplifikasjon (LAMP) av noen gjenværende organiske løsningsmidler som etanol og isopropanol i nukleinsyreisoleringsreagenser [20].Væske-væske-ekstraksjon og fastfase-ekstraksjon er de mest populære metodene for å isolere nukleinsyrer [21], men væske-væske-ekstraksjon på en brikke er ekstremt begrenset, siden reagensene som brukes i væske-væske-ekstraksjon forårsaker korrosjon av de fleste mikrofluidiske brikker. .Her fremhever vi mikroarray-baserte fastfaseekstraksjonsmetoder og sammenligner fordelene og ulempene deres.
Silisium er et substratmateriale som er kompatibelt med nukleinsyrer på grunn av dets biokompatibilitet, stabilitet og enkle modifikasjoner [22].Viktigere, når modifisert med silika eller andre materialer, viser denne kompositten egenskaper til å adsorbere negativt ladede nukleinsyrer under lav pH, høye saltforhold mens den elueres med høy pH, lav saltløsning.Basert på dette fenomenet er det mulig å rense nukleinsyren.
Ulike former for silikabaserte materialer har blitt brukt til nukleinsyreekstraksjon i mikrofluidik, slik som silikakuler, pulver, mikrofiberfiltre og silikamembraner [23, 24, 25, 26].Avhengig av materialets egenskaper kan silisiumbaserte materialer brukes i mikrokretser på forskjellige måter.For eksempel kan silikagranuler, pulvere og kommersielle nanofiltre ganske enkelt plasseres i porene eller mikrokanalene til mikrofluidiske brikker og hjelpe til med å trekke ut nukleinsyrer fra prøver [27, 28, 29].Overflatemodifiserte silikamembraner kan også brukes til å raskt rense DNA fra patogener til lave kostnader.For eksempel, Wang et al.[30] Ved å kombinere denaturerende amplifikasjonsreaksjoner med vesikkelmediert kjedeutveksling med silikamembraner belagt med kitosan-oligosakkarider, ble et allsidig bærbart system introdusert som vellykket oppdaget 102–108 kolonidannende enheter.(CFU)/ml Vibrio parahaemolyticus., og tilstedeværelsen av viruset var lett synlig.Powell et al.[31] Silisiumbaserte mikroarrayer ble deretter brukt til å oppdage hepatitt C-virus (HCV), humant immunsviktvirus (HIV), Zika-virus og humant papillomavirus og automatisk forplantning, der en 1,3 μl kronglete mikroreaktor ble utviklet for å fange RNA-virus.og utføre in situ forsterkning.I tillegg til disse metodene spiller overflatemodifiserte silikamikrokolonner også en nøkkelrolle i nukleinsyreekstraksjon, da geometrien og egenskapene til det modifiserende materialet øker ekstraksjonseffektiviteten i stor grad.Chen et al.[32] foreslo en mikrofluidisk plattform for isolering av lavkonsentrasjon RNA basert på aminobelagte silisiummikrokolonner.Denne mikrofluidenheten integrerer en rekke 0,25 cm2 mikrosøyler på et silisiumsubstrat for å oppnå høyere ekstraksjonseffektivitet gjennom et design med høyt overflateareal til volumforhold.Fordelen med denne utformingen er at den mikrofluidiske enheten kan oppnå opptil 95 % nukleinsyreekstraksjonseffektivitet.Disse silisiumbaserte strategiene viser verdien av å raskt isolere nukleinsyrer til lave kostnader.I kombinasjon med mikrofluidiske brikker kan silisiumbaserte ekstraksjonsstrategier ikke bare øke effektiviteten av nukleinsyredeteksjon, men også lette miniatyrisering og integrering av analytiske enheter [20].
Magnetiske separasjonsmetoder bruker magnetiske partikler for å isolere nukleinsyrer i nærvær av et eksternt magnetfelt.Vanlig brukte magnetiske partikler inkluderer Fe3O4 eller γ-Fe2O3 magnetiske partikler belagt med silika, amino og karboksyl [33,34,35,36].Den karakteristiske egenskapen til magnetiske partikler sammenlignet med silisiumbaserte SPE-metoder er den enkle manipulering og kontroll med eksterne magneter.
Ved å bruke den elektrostatiske interaksjonen mellom nukleinsyrer og silika, under forhold med høyt salt og lav pH, adsorberes nukleinsyrer på overflaten av silikabelagte magnetiske partikler, mens under forhold med lavt salt og høy pH, kan molekylene vaskes en gang til..Silika-belagte magnetiske perler gjør det mulig å ekstrahere DNA fra store volumprøver (400 μL) ved hjelp av magnetisk kontrollert bevegelse [37].Som en demonstrasjon har Rodriguez-Mateos et al.[38] brukte avstembare magneter for å kontrollere overføringen av magnetiske perler til forskjellige kamre.Basert på silikabelagte magnetiske partikler, kan 470 kopier/ml av SARS-CoV-2 genomisk RNA ekstraheres fra avløpsvannprøver for LAMP revers transkripsjonsdeteksjon (RT-LAMP) og responsen kan leses innen 1 time.det blotte øye (fig. 2a).
Enheter basert på magnetiske og porøse materialer.Konseptuellt diagram av IFAST RT-LAMP mikrofluidisk enhet for SARS-CoV-2 RNA-deteksjon (tilpasset fra [38]).b Sentrifugal mikroenhet for dSPE av bukkal vattpinne nukleinsyre (tilpasset fra [39]).c Innebygd selvdrevet prøvekonsentrator som bruker et FTA®-kort (tilpasset fra [50]).d Fusion 5 filterpapir modifisert med kitosan (tilpasset fra [51]).SARS-CoV-2 alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus 2, RT-LAMP revers transkripsjonssløyfe-mediert isotermisk amplifikasjon, FTA finders teknologipartnere, NA nukleinsyre
Positivt ladede magnetiske partikler er ideelle for å feste fosfatryggraden i en nukleinsyre.Ved en viss saltkonsentrasjon kan de negativt ladede fosfatgruppene av nukleinsyrer være positivt ladet på overflaten av de magnetiske komposittpartiklene.Derfor ble det utviklet magnetiske nanopartikler med ru overflate og høy tetthet av aminogrupper for utvinning av nukleinsyrer.Etter magnetisk separasjon og blokkering kan magnetiske nanopartikler og DNA-komplekser brukes direkte i PCR, noe som eliminerer behovet for komplekse og tidkrevende rense- og elueringsoperasjoner [35].Magnetiske nanopartikler belagt med negative karboksylgrupper har også blitt brukt for å separere nukleinsyrer adsorbert på overflater i høykonsentrasjoner av polyetylenglykol og natriumkloridløsninger [36].Med disse overflatemodifiserte magnetiske kulene er DNA-ekstraksjon kompatibel med påfølgende amplifikasjon.Dignan et al.[39] beskrev en automatisert og bærbar sentrifugal mikrofluidisk plattform for nukleinsyreforbehandling, slik at ikke-teknisk personell kan bruke den på stedet.I tillegg demonstrerer kompatibiliteten til det isolerte DNAet med LAMP, en metode som er godt egnet for nukleinsyreanalyse, minimalt med utstyr og egnethet for kolorimetriske analyser (fig. 2b).
Magnetiske perlemetoder tilbyr muligheten for automatisert ekstraksjon, hvorav noen finnes i kommersielle automatiserte nukleinsyreekstraktorer [KingFisher;ThermoFisher (Waltham, MA, USA), QIAcube® HT;CapitalBio (Beijing, Kina) og Biomek®;Beckman (Miami, USA).), Florida, USA)].Fordelene ved å kombinere magnetiske perler med mikrofluidikk kan brukes til effektiv automatisert utvinning av nukleinsyrer, noe som potensielt kan fremme utviklingen av molekylær diagnostikk;Imidlertid er kombinasjonen av magnetiske perler med mikrofluidikk fortsatt sterkt avhengig av komplekse kontrollsystemer for presis manipulering av magnetiske perler, noe som forklarer populariteten til kommersielle produkter er klumpete og dyre, noe som begrenser den videre bruken av magnetiske perler i POCT.
Flere porøse materialer som modifiserte nitrocellulosefiltre, Finders Technology Associates (FTA)-kort, polyetersulfonbaserte filterpapir og glykanbelagte materialer har også blitt brukt til nukleinsyredeteksjon [40, 41, 42, 43, 44].Porøse fibrøse materialer som fibrøst papir ble først brukt til å isolere DNA ved fysisk å vikle langtrådede DNA-molekyler med fibre.Små porer fører til en sterk fysisk begrensning av DNA-molekyler, noe som påvirker DNA-ekstraksjonen positivt.På grunn av de forskjellige porestørrelsene til fibrøst papir, kan ikke ekstraksjonseffektiviteten møte behovene til DNA-amplifisering [45, 46].FTA-kortet er et kommersielt filterpapir som brukes innen rettsmedisin og mye brukt i andre områder av molekylær diagnostikk.Gjennom bruk av cellulosefilterpapir impregnert med ulike kjemikalier for å lysere cellemembranene i prøven, er det frigjorte DNAet beskyttet mot nedbrytning i opptil 2 år.Nylig har impregnert cellulosepapir blitt utviklet for molekylær påvisning av ulike patogener, inkludert SARS-CoV-2, leishmaniasis og malaria [47,48,49].HIV i det isolerte plasmaet lyseres direkte, og den virale nukleinsyren anrikes i FTA® flow-membranen innebygd i konsentratoren, noe som muliggjør effektiv produksjon av nukleinsyren [50] (fig. 2c).Hovedproblemet med nukleinsyredeteksjon ved bruk av FTA-kort er at kjemikalier som guanidin og isopropanol hemmer påfølgende amplifikasjonsreaksjoner.For å løse dette problemet utviklet vi Fusion 5 kitosanmodifisert filterpapir, som kombinerer fordelene med både fysisk sammenfletting av DNA-molekyler og fibrøst filterpapir, og elektrostatisk adsorpsjon av DNA på kitosanmodifiserte forbindelser for å oppnå svært effektiv nukleinsyreekstraksjon ..filterfibre [51] (fig. 2d).Tilsvarende har Zhu et al.[52] demonstrerte en kitosan-modifisert PCR-metode basert på et in situ kapillært mikrofluidsystem for rask isolering og påvisning av Zika-virus-RNA.Nukleinsyrer kan adsorberes/desorberes i henholdsvis et blandet lysat/PCR-medium, basert på av/på-bryteregenskapen til kitosan.på og av", reagerer på pH.
Som nevnt ovenfor kombinerer disse strategiene fordelene med forskjellige fastfasematerialer og øker effektiviteten av nukleinsyreekstraksjon i mikrofluidik.I praktiske applikasjoner er bruk av disse materialene i store mengder uøkonomisk, og riktig overflatebehandling eller overflatemodifisering av vanlige materialer med disse materialene kan også bevare deres funksjon.Derfor antas det at implementering av disse strategiene etter en pilotstudie kan redusere kostnadene.
Nukleinsyretesting på mikrofluidplattformer bruker ofte små prøvevolumer (< 100 µl), og krever derfor amplifisering av målnukleinsyrene med spesifikke prober for konvertering til et signal som er praktisk for nedstrøms deteksjon (optisk, elektrisk og magnetisk) [53, 54]. Nukleinsyretesting på mikrofluidplattformer bruker ofte små prøvevolumer (< 100 µl), og krever derfor amplifisering av målnukleinsyrene med spesifikke prober for konvertering til et signal som er praktisk for nedstrøms deteksjon (optisk, elektrisk og magnetisk) [53, 54]. При тестировании нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах часто используются небольшие объемы образцов (< 100 мкл), поэтому требуется амплификация целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигнал, удобный для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]. Når du tester nukleinsyrer på mikrofluidiske plattformer, brukes ofte små prøvevolumer (<100 µL), så amplifisering av målnukleinsyrer med spesielle prober er nødvendig for å konvertere det til et signal som er praktisk for påfølgende deteksjon (optisk, elektrisk og magnetisk) [53, 54].微流控 平台 上 的 检测 通常 使用 小样本量 （<100 μL） ， 因此 使用 使用 特定 探针 扩增 目标 ， ， 转换 为 便于 下游 检测 （光学 、 电学 磁学） 的 便于 便于 下游 下游 检测 （光学 、 电学 磁学） 的 便于 便于 下游 下游 检测 特定 特定 特定 特定 特定 特定 特定 特定 特定 特定 特定 特定 特定 特定 特定 特定 特定 使用 通常 通常 通常 通常 通常 通常 通常 通常 通常 通常 通常 通常 通常 通常 通常 通常 通常 通常 通常 通常 通常 通常 通常 通常 通常 通常 通常 通常 通常 通常 通常 通常 通常 通常 通常 通常 通常 通常 通常 通常 通常 通常. ].微流控 平台 上 的 检测 使用 使用 小样本量 （（<100 μL） ， 因此 特定 特定 探针 扩增 目标 ， 以 为 下游 下游 （光学 、 电学 磁学） 的 信号 [53, 54, 54, 54 ]. Обнаружение нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах обычно использует небольшие объемы образцов (<100 мкл), что требует амплификации целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигналы для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]]. Deteksjon av nukleinsyrer på mikrofluidiske plattformer bruker vanligvis små prøvevolumer (<100 μl), som krever amplifisering av målnukleinsyrer med spesielle prober for å konvertere dem til signaler for påfølgende deteksjon (optisk, elektrisk og magnetisk) [53, 54]] .Nukleinsyreamplifikasjon i mikrofluidikk kan også fremskynde reaksjoner, optimalisere deteksjonsgrenser, redusere prøvekrav og forbedre deteksjonsnøyaktigheten [55, 56].I de senere årene, med realiseringen av rask og nøyaktig deteksjon, har forskjellige nukleinsyreamplifikasjonsmetoder blitt brukt i mikrofluidikk, inkludert PCR og noen isotermiske amplifikasjonsreaksjoner.Denne delen vil oppsummere metoder for nukleinsyredeteksjon basert på mikrofluidiske systemer.
PCR er en simulering av DNA-replikasjonsprosessen til en organisme, hvor teorien er beskrevet i detalj andre steder og vil ikke bli diskutert her.PCR kan forsterke en svært liten mengde mål-DNA/RNA med en eksponentiell hastighet, noe som gjør PCR til et kraftig verktøy for rask påvisning av nukleinsyrer.I de siste tiårene har mange bærbare mikrofluidenheter utstyrt med PCR termiske syklussystemer blitt utviklet for å møte behovene til behandlingspunktdiagnostikk [57, 58].On-chip PCR kan deles inn i fire typer (konvensjonell, kontinuerlig strømning, romlig svitsjet og konvektiv PCR) i henhold til forskjellige temperaturkontrollmetoder [59].For eksempel, Gee et al.[60] utviklet en direkte revers transkripsjon kvantitativ PCR (RT-qPCR) metode på deres egen mikrofluidisk plattform for multipleks deteksjon av SARS-CoV-2, influensa A og B virus i halsprøver (fig. 3a).Park et al.[61] bygget en enkel patogenanalysebrikke ved å integrere tynnfilm-PCR, elektroder og en fingeroperert polydimetylsiloksan-basert mikrofluidmodul.Imidlertid legemliggjør begge verkene de vanlige manglene ved konvensjonell PCR.PCR krever termisk syklus, noe som begrenser ytterligere miniatyrisering av enheten og redusert testtid.
Utviklingen av kontinuerlig strømningsbasert mikrofluidisk og romsvitsjet PCR er avgjørende for å løse dette problemet.Ved å bruke en lang serpentinkanal eller en kort rett kanal kan PCR med kontinuerlig strøm gi rask forsterkning ved aktivt å sirkulere reagenser i tre forvarmingssoner med en off-chip-pumpe.Denne operasjonen unngår vellykket overgangsfasen mellom forskjellige reaksjonstemperaturer og reduserer dermed testtiden betydelig [62] (fig. 3b).I en annen studie av Jung et al.[63] foreslo en ny roterende genetisk PCR-analysator som kombinerer egenskapene til fast og flow-PCR for ultrarask og multipleks revers transkripsjons-PCR (fig. 3c).For nukleinsyreamplifisering vil PCR-mikrobrikken roteres gjennom tre varmeblokker ved forskjellige temperaturer: 1. Denatureringsblokk 94°C, 2. Annealingsblokk ved 58°C, 3. Ekspansjonsblokk ved 72°C.
Anvendelse av PCR i mikrofluidikk.Skjematisk representasjon av dirRT-qPCR på en mikrofluidisk plattform (tilpasset fra [60]).b Skjematisk representasjon av et PCR-mikroarray med kontinuerlig flyt basert på en serpentinkanal (tilpasset fra [62]).c Skjematisk representasjon av en roterende PCR genetisk analysator, bestående av en mikrobrikke, tre varmeblokker og en trinnmotor (tilpasset [63]).d Diagram over termokonveksjon PCR med sentrifugering og oppsett (tilpasset fra [64]).DirRT-qPCR, direkte kvantitativ revers transkripsjonspolymerasekjedereaksjon
Ved å bruke kapillærer og løkker eller til og med tynne plater, kan konveksjons-PCR raskt forsterke nukleinsyrer ved naturlig fri termisk konveksjon uten behov for en ekstern pumpe.For eksempel ble en syklisk olefinpolymer mikrofluidisk plattform utviklet på et fabrikkert roterende oppvarmingstrinn som bruker termisk syklus med sentrifugering i en PCR-sløyfemikrokanal [64] (fig. 3d).Reaksjonsløsningen drives av termisk konveksjon, som kontinuerlig utveksler høy og lav temperatur i en mikrokanal med ringformet struktur.Hele amplifikasjonsprosessen kan fullføres på 10 minutter med en deteksjonsgrense på 70,5 pg/kanal.
Som forventet er rask PCR et kraftig verktøy for fullt integrerte prøverespons molekylær diagnostikk og multipleks analysesystemer.Rask PCR reduserer tiden det tar å oppdage SARS-CoV-2 betydelig, noe som bidrar til effektiv kontroll av COVID-19-pandemien.
PCR krever en kompleks termisk syklus som ikke er egnet for POCT.Nylig har isotermiske amplifikasjonsteknikker blitt brukt på mikrofluidik, inkludert men ikke begrenset til LAMP, rekombinasepolymerase-amplifikasjon (RPA) og amplifikasjon basert på nukleinsyresekvenser [65,66,67,68].Med disse teknikkene blir nukleinsyrer amplifisert ved en konstant temperatur, noe som gjør det lettere å lage rimelige, svært følsomme bærbare POCT-enheter for molekylær diagnostikk.
Mikrofluidikkbaserte LAMP-analyser med høy gjennomstrømning tillater multippel påvisning av infeksjonssykdommer [42, 69, 70, 71].I kombinasjon med et sentrifugalt mikrofluidsystem kan LAMP ytterligere lette automatiseringen av nukleinsyredeteksjon [69, 72, 73, 74, 75].Spin-and-react SlipChip ble utviklet for visuell påvisning av flere parallelle bakterier ved bruk av LAMP [76] (fig. 4a).Ved bruk av optimalisert LAMP i analysen var fluorescenssignal-til-støy-forholdet omtrent 5 ganger, og deteksjonsgrensen nådde 7,2 kopier/μl av genomisk DNA. I tillegg ble eksistensen av fem vanlige fordøyelsesbakteriepatogener, inkludert Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis og Vibrio parahaemolyticus, visualisert basert på metoden på < 60 min. I tillegg ble eksistensen av fem vanlige fordøyelsesbakteriepatogener, inkludert Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis og Vibrio parahaemolyticus, visualisert basert på metoden på < 60 min.Dessuten ble tilstedeværelsen av fem vanlige bakterielle patogener i fordøyelseskanalen, inkludert Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis og Vibrio parahaemolyticus, visualisert ved å bruke denne metoden på mindre enn 60 minutter.此外，基于该方法在<60分钟内可视化了五种常见消化道细菌病原体的存在，包括蜡状芽孢杆菌、大肠杆菌、肠沙门氏菌、河流弧菌和副溶血性弧菌。此外 ， 基于 该 方法 在 <60 分钟 内 视化 了 五 种 常见 消化道 细菌病 的 存在 ， 包括 芽孢杆菌 、 大 肠杆菌 、 肠 氏 菌 、 弧菌 和 副溶血性。。。 弧菌 弧菌 弧菌弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 HIPI tillegg ble tilstedeværelsen av fem vanlige bakterielle gastrointestinale patogener, inkludert Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvius og Vibrio parahaemolyticus, visualisert ved bruk av denne metoden på mindre enn 60 minutter.
Fordelene med LAMP i mikrofluidikk inkluderer blant annet rask respons og miniatyrisert deteksjon.På grunn av reaksjonstemperaturen (rundt 70 °C) genereres imidlertid aerosoler uunngåelig under LAMP, noe som resulterer i en høy falsk positiv rate.Analysespesifisitet, primerdesign og temperaturkontroll må også optimaliseres for LAMP.I tillegg er brikkedesign som implementerer flere måldeteksjon på en enkelt brikke av stor verdi og bør utvikles.I tillegg er LAMP egnet for flerbruksdeteksjon integrert i én brikke, noe som er av stor betydning, men det er fortsatt mye rom for utvikling.
Den høye falske positive raten av LAMP kan delvis reduseres med RPA, da den relativt lave reaksjonstemperaturen (~37 °C) resulterer i relativt få fordampningsproblemer [77].I RPA-systemet initierer to motsatte primere DNA-syntese ved binding til en rekombinase og amplifikasjon kan fullføres innen 10 minutter [78,79,80,81].Derfor er hele RPA-prosessen mye raskere enn PCR eller LAMP.De siste årene har mikrofluidisk teknologi vist seg å forbedre hastigheten og nøyaktigheten til RPA [82,83,84].For eksempel, Liu et al.[85] utviklet en mikrofluidisk integrert lateral flow polymerase rekombinase amplifikasjonsanalyse for rask og sensitiv påvisning av SARS-CoV-2 ved å integrere revers transkripsjon RPA (RT-RPA) og et universelt lateral flow teststrimmeldeteksjonssystem.inn i et enkelt mikrofluidsystem.Figur 4b).Deteksjonsgrensen er 1 kopi/µl eller 30 kopier/prøve, og deteksjonen kan fullføres på ca. 30 minutter.Kong et al.har utviklet en bærbar mikrofluidisk enhet.[86] brukte kroppstemperatur og et mobiltelefonbasert fluorescensdeteksjonssystem for raskt og direkte å oppdage HIV-1-DNA ved hjelp av RPA (Figur 4c).Den bærbare RPA-analysen oppdager 100 kopier/ml av målsekvensen innen 24 minutter, og viser et stort potensial for rask diagnose av HIV-1-infiserte spedbarn i ressursbegrensede omgivelser.
Isoterm forsterkning i point-of-care testing (POCT).Utvikling og produksjon av spinn og reaksjon SlipChip.Etter plasmasveising ble topp- og bunnbrikkene satt sammen med et sett muttere for å danne den endelige brikken (tilpasset fra [76]).b Skjematisk av MI-IF-RPA-systemet for COVID-19-deteksjon (tilpasset fra [85]).c Skjematisk av en bærbar RPA-test for rask påvisning av HIV-1 DNA (tilpasset [86]).SE Salmonella enterica, VF Vibrio fluvius, VP Vibrio parahaemolyticus, BC Bacillus cereus, EC Escherichia coli, FAM karboksyfluorescein, humant immunsviktvirus HIV, RPA-rekombinasepolymerase-amplifikasjon, LED-lysemitterende diode, MI-IF-Low-RPA-integrert mikrobin-recombinase-polymerase Forsterkning
Mikrofluidbasert RPA utvikler seg raskt, men kostnadene for chipproduksjon og reaksjonsforbruk er for høye og må reduseres for å øke tilgjengeligheten til denne teknologien.I tillegg kan den høye sensitiviteten til RPA påvirke amplifiseringen av ikke-spesifikke produkter, spesielt i nærvær av kontaminering.Disse begrensningene kan påvirke anvendelsen av RPA i mikrofluidiske systemer og fortjener ytterligere optimalisering.Godt utformede primere og prober for ulike mål er også nødvendig for å forbedre gjennomførbarheten av RPA-baserte mikrofluidstrategier i POCT.
Cas13 og Cas12a har evnen til å spalte nukleinsyrer tilfeldig og kan dermed utvikles som deteksjons- og diagnostiske verktøy.Cas13 og Cas12a aktiveres ved binding til henholdsvis mål-DNA eller RNA.Når det er aktivert, begynner proteinet å spalte andre nærliggende nukleinsyrer, hvoretter guide-RNA-er rettet mot patogenspesifikke nukleinsyrer kan spalte slukkede fluorescerende prober og frigjøre fluorescens.Basert på denne teorien har Kellner et al.[87] utviklet en Cas13-basert metode [Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKING (SHERLOCK)], og Broughton et al.[88] utviklet en annen tilnærming basert på Cas12a [CRISPR Trans Reporter rettet mot DNA-endonuklease (DTECR)].
De siste årene har det dukket opp ulike metoder for påvisning av nukleinsyrer basert på CRISPR [89, 90].Konvensjonelle CRISPR-baserte metoder er ofte tidkrevende og arbeidskrevende på grunn av flere prosedyrer, inkludert nukleinsyreekstraksjon, amplifikasjon og CRISPR-deteksjon.Eksponering av væsker for luft kan øke sjansen for falske positive resultater.Gitt ovenstående, trenger CRISPR-baserte systemer et stort behov for optimalisering.
En pneumatisk kontrollert mikrofluidisk plattform som kan utføre 24 analyser parallelt er utviklet for CRISPR-Cas12a og CRISPR-Cas13a deteksjonsapplikasjoner [91].Systemet er utstyrt med en fluorescensdeteksjonsenhet som omgår nukleinsyreamplifikasjon og automatisk oppdager femtomolare DNA- og RNA-prøver.Chen et al.[92] integrert rekombinase-amplifikasjon med CRISPR-Cas12a-systemet i sentrifugale mikrofluidikk (fig. 5a).Dette arbeidet overvinner vanskeligheten med å integrere disse to prosessene fordi Cas12a kan fordøye messenger-DNA og hemme amplifikasjonsprosessen.I tillegg har Chen et al.[92] i tillegg forhåndslagret reaksjonsreagensene i en sentrifugal mikrofluidisk kontroll for automatisk å fullføre hele prosessen.I et annet arbeid har Silva et al.[93] utviklet en diagnostisk metode uten CRISPR/Cas12a-forsterkning og en smarttelefon for å oppdage SARS-CoV-2 (fig. 5b).Denne analysen, kjent som et mobiltelefonbasert amplifikasjonsfritt system, inkluderer et CRISPR/Cas-avhengig enzym som er basert på smarttelefonvisualisering av katalase-genererte boblesignaler i mikrofluidkanaler.Sensitiv påvisning av mindre enn 50 kopier/µl nukleinsyre uten pre-amplifisering, hele prosessen fra prøveinjeksjon til signalavlesning tar bare 71 minutter.
Nukleinsyredeteksjonsmetoder basert på CRISPR.Sentrifugal POCT for integrert molekylær diagnostikk basert på CRISPR (tilpasset fra [92]).b Utvikling av CASCADE-testen for smarttelefonbasert analyse av SARS-CoV-2 (tilpasset [93]).RAA-rekombinaseamplifikasjon, PAM-tilstøtende protospacer-motiv, CRISPR-grupperte korte palindromiske repetisjoner med jevne mellomrom, CASCADE-system uten mobiltelefonamplifikasjon med CRISPR/CAS-avhengige enzymer, 1-etyl-3-[3-dimetylaminopropyl]karbodiimidhydroklorid EDC
Som det siste trinnet i nukleinsyredeteksjon, reflekterer signaldeteksjon direkte diagnostiske resultater og er en kritisk faktor i utviklingen av en effektiv, sensitiv og nøyaktig POCT.Signaler kan leses ved hjelp av ulike metoder som fluorescerende, elektrokjemiske, kolorimetriske og magnetiske strategier.I denne delen beskriver vi begrunnelsen for hver tilnærming og sammenligner den molekylære diagnostikken av infeksjonssykdommer i mikrofluidikk.
Fluorescensbaserte strategier er mye brukt for POCT-diagnostikk av infeksjonssykdommer på grunn av deres bemerkelsesverdige fordeler med utmerket følsomhet, lave kostnader, enkel betjening og behandlingspunktanalyse [94, 95].Disse strategiene bruker merkede fluoroforer som fluorescerende fargestoffer og nanomaterialer for å skape et detekterbart signal (fluorescensforbedring eller quenching).Dette funnet antyder at fluorescensbaserte strategier kan deles inn i direkte fluorescerende merking, signal-on og signal-off fluorescensdeteksjon [96].Direkte fluorescerende etikettdeteksjon bruker spesielle fluorescerende etiketter for å merke spesifikke ligander som genererer en spesifikk mengde fluorescens når de er selektivt bundet til et mål.For signalbasert fluorescensdeteksjon er kvaliteten på det fluorescerende signalet positivt relatert til størrelsen av interesse.Fluorescensintensiteten er ubetydelig i fravær av et mål og kan påvises når en tilstrekkelig mengde mål er tilstede.Motsatt er intensiteten av fluorescens detektert av "signal-off" fluorescens omvendt proporsjonal med mengden av mål, først når en maksimal verdi og avtar gradvis når målet forstørres.For eksempel ved å bruke den CRISPR-Cas13a målavhengige trans-spaltningsmekanismen, Tian et al.[97] utviklet en ny gjenkjennelsesstrategi for å oppdage RNA som omgår revers transkripsjon direkte (fig. 6a).Ved binding til komplementære mål-RNA-er, kan CRISPR-Cas13-RNA-komplekset aktiveres, og utløse transkollateral spaltning av ikke-spesifikke reporter-RNA.Den fluorescensmerkede reporteren [fluorofor (F)] slukkes av quencheren (Q) intakt og fluorescerer når den spaltes av det aktiverte komplekset.
Fordelen med elektrokjemisk deteksjon er høy deteksjonshastighet, enkel produksjon, lav pris, lett å bære og automatisk kontroll.Det er en kraftig analytisk metode for POCT-applikasjoner.Basert på grafenfelteffekttransistorer Gao et al.[98] utviklet en nanobiosensor for multipleksdeteksjon av borreliose-antigener fra Borrelia burgdorferi-bakterier med en deteksjonsgrense på 2 pg/mL (fig. 6b).
Kolorimetriske analyser har blitt brukt i POCT-applikasjoner, og drar fordel av fordelene med portabilitet, lave kostnader, enkel forberedelse og visuell lesing.Kolorimetrisk deteksjon kan bruke oksidasjon av peroksidase eller peroksidase-lignende nanomaterialer, aggregering av nanomaterialer og tilsetning av indikatorfargestoffer for å konvertere informasjon om tilstedeværelsen av målnukleinsyrer til synlige fargeendringer [99, 100, 101].Spesielt er gullnanopartikler mye brukt i utviklingen av kolorimetriske strategier, og på grunn av deres evne til å indusere raske og betydelige fargeendringer, er det økende interesse for utviklingen av POCT kolorimetriske plattformer for in situ diagnose av infeksjonssykdommer [102].Med en integrert sentrifugal mikrofluidisk enhet [103] kan matbårne patogener i kontaminerte melkeprøver automatisk oppdages på nivå med 10 bakterieceller, og resultatene kan leses visuelt innen 65 minutter (fig. 6c).
Magnetiske sanseteknikker kan nøyaktig oppdage analytter ved bruk av magnetiske materialer, og det har vært betydelig interesse for POCT-applikasjoner de siste tiårene.Magnetiske sanseteknikker har noen unike fordeler som lavkost magnetiske materialer i stedet for dyre optiske komponenter.Imidlertid forbedrer bruken av et magnetfelt deteksjonseffektiviteten og reduserer prøveforberedelsestiden [104].I tillegg viser resultatene av magnetisk sondering høy spesifisitet, sensitivitet og høyt signal-til-støy-forhold på grunn av det ubetydelige magnetiske bakgrunnssignalet til biologiske prøver [105].Sharma et al.integrert en magnetisk tunnelkryssbasert biosensor i en bærbar mikrobrikkeplattform.[106] for multipleks deteksjon av patogener (fig. 6d).Biosensorer oppdager sensitivt subnanomolare nukleinsyrer isolert fra patogener.
Typisk signaldeteksjonsmetode.Konseptet med hyperlokalisert deteksjon av Cas13a (tilpasset fra [97]).b Grafen nanobiosensor FET i kombinasjon med Lyme GroES scFv (tilpasset fra [98]).c Kolorimetriske indikasjoner for multipleks påvisning av matbårne patogener i en sentrifugal mikrofluidisk brikke: nr. 1 og nr. 3 prøver med målpatogener, og nr. 2, nr. 4 og nr. 5 prøver uten målpatogener (tilpasset fra [103]) .d Biosensor basert på et magnetisk tunnelkryss, inkludert en plattform, en innebygd blokkeringsforsterker, en kontrollenhet og en strømforsyning for signalgenerering/innhenting (tilpasset fra [106]).GFET Graphene FET, Escherichia coli, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio parahaemolyticus, Listeria monocytogenes, PC PC, PDMS Dimethicone, PMMA polymetylmetakrylat
Til tross for de utmerkede egenskapene til de ovennevnte deteksjonsmetodene, har de fortsatt ulemper.Disse metodene sammenlignes (tabell 1), inkludert noen applikasjoner med detaljer (fordeler og ulemper).
Med utviklingen av mikrofluidikk, mikroelektromekaniske systemer, nanoteknologi og materialvitenskap, går bruken av mikrofluidiske brikker for påvisning av smittsomme sykdommer stadig fremover [55,96,107,108].Nøyaktig manipulering av miniatyrutstyr og væsker bidrar til diagnostisk nøyaktighet og kostnadseffektivitet.For videre utvikling er det derfor arbeidet med å optimalisere og oppgradere brikkene, noe som har resultert i ulike mikrofluidiske brikker med ulike strukturer og funksjoner.Her introduserer vi kort flere vanlige typer mikrofluidiske plattformer og sammenligner deres egenskaper (fordeler og ulemper).I tillegg fokuserer de fleste eksemplene nedenfor først og fremst på bekjempelse av SARS-CoV-2.
LOCC-er er de vanligste miniatyriserte komplekse analytiske systemene, og deres operasjoner er svært miniatyrisert, integrert, automatisert og parallellisert fra prøveinjeksjon og -preparering, strømningskontroll og væskedeteksjon [109, 110].Væsker manipuleres gjennom nøye utformet geometri og samspillet mellom mange fysiske effekter som trykkgradienter, kapillærvirkning, elektrodynamikk, magnetiske felt og akustiske bølger [111].LOCC viser utmerkede fordeler innen screening med høy gjennomstrømning og multippel deteksjon, med rask analysehastighet, liten prøvestørrelse, lavt strømforbruk og høy styrings- og driftseffektivitet;LOCC-enheter er imidlertid veldig delikate, og produksjon, pakking og grensesnitt.Imidlertid møter multipleksing og gjenbruk enorme vanskeligheter [96].Sammenlignet med andre plattformer har LOCC unike fordeler i form av maksimal applikasjonsmangfold og beste teknologikompatibilitet, men ulempene er også åpenbare, nemlig høy kompleksitet og dårlig repeterbarhet.Avhengighet av eksterne pumper, som ofte er klumpete og dyre, begrenser bruken deres i POCT ytterligere.
Under COVID-19-utbruddet fikk LOCC mye oppmerksomhet.Samtidig er det flere nye brikker som kombinerer flere teknologier.For eksempel er smarttelefoner nå mye brukt som bærbare analyseenheter og har stort potensial for LOCC-integrasjon.Sun et al.[21] produserte en mikrofluidisk brikke som tillater multipleksing av spesifikke nukleinsyresekvenser av fem patogener, inkludert SARS-CoV-2, ved å bruke LAMP og analyserte dem ved hjelp av en smarttelefon innen 1 time etter slutten av reaksjonen.Som et annet eksempel, Sundah et al.[112] opprettet en molekylær svitsj [katalytisk amplifikasjon ved molekylær overgangstilstandsbryter (CATCH)] for direkte og sensitiv påvisning av SARS-CoV-2 RNA-mål ved hjelp av smarttelefoner. CATCH er kompatibel med bærbar LOCC og oppnår overlegen ytelse (omtrent 8 RNA-kopier/μl; < 1 time ved romtemperatur) [112]. CATCH er kompatibel med bærbar LOCC og oppnår overlegen ytelse (omtrent 8 RNA-kopier/μl; < 1 time ved romtemperatur) [112]. CATCH совместим с портативным LOCC и обеспечивает превосходную производительность (примерно 8 копий РНЕН 1мкон РНН 1м. CATCH er kompatibel med bærbar LOCC og gir utmerket gjennomstrømning (omtrent 8 RNA-kopier/µl; < 1 time ved romtemperatur) [112]. CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 尀温下 CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 尀温下 CATCH совместим с портативными LOCC og обладает превосходной производительностью (примерно 8 копий РНК/1 премно РНК/1 примен. CATCH er kompatibel med bærbare LOCC-er og har utmerket ytelse (omtrent 8 RNA-kopier/µl; < 1 time ved romtemperatur) [112].I tillegg bruker LOCC-enheter for molekylær diagnostikk også noen drivkrefter som vakuum, strekk og elektriske felt.Kang et al.[113] demonstrerte en sanntids, ultrarask nanoplasma-på-en-brikke PCR for rask og kvantitativ diagnose av COVID-19 i felt ved bruk av en vakuumplasmonisk flytende PCR-brikke.Li et al.[114] utviklet deretter en strekkdrevet mikrofluidisk brikke som muliggjorde diagnosen COVID-19.Plattformen bruker RT-LAMP-amplifikasjonssystemet for å bestemme om en prøve er kvalitativt positiv eller negativ.Deretter har Ramachandran et al.[115] oppnådde passende elektriske feltgradienter ved bruk av isotakoforese (ITP), en selektiv ionefokuseringsteknikk implementert i mikrofluidikk.Med ITP kan mål-RNA fra rå nasofaryngeale vattpinneprøver renses automatisk.Deretter Ramachandran et al.[115] Ved å kombinere denne ITP-rensingen med ITP-forsterkede LAMP- og CRISPR-analyser oppdaget SARS-CoV-2 i human nasofaryngeal vattpinne og kliniske prøver i løpet av ca. 35 minutter.I tillegg dukker det stadig opp nye ideer.Jadhav et al.[116] foreslo et diagnostisk opplegg basert på overflateforbedret Raman-spektroskopi i kombinasjon med en mikrofluidisk enhet som inneholder enten vertikalt orienterte gull/sølvbelagte karbon-nanorør eller elektrospunnet mikro/nanorør for engangsbruk.Membranfunksjonaliserte innebygde filtermikrokanaler er engangs.Enheten adsorberer virus fra ulike kroppsvæsker/eksudasjoner som spytt, nasofarynx og tårer.Dermed er virustiteren rikelig, og viruset kan identifiseres nøyaktig med Raman-signaturen.
LOAD er en sentrifugal mikrofluidisk plattform der alle prosesser styres av en frekvensprotokoll som roterer et mikrostrukturert substrat [110].LOAD-enheten kjennetegnes ved å bruke sentrifugalkraft som en viktig drivkraft.Væsker er også utsatt for kapillær-, Euler- og Coriolis-krefter.Ved hjelp av en sentrifugeanordning utføres analyser i kontinuerlig væskedrift fra en radial innover til ytre posisjon, noe som eliminerer behovet for ytterligere eksterne slanger, pumper, aktuatorer og aktive ventiler.Kort sagt, en enkelt kontrollmetode forenkler driften.Kreftene som virker på væsken i samme mikrofluidkanal i samme avstand fra lastsenteret er like, noe som gjør det mulig å gjenta kanalstrukturen.Dermed er LOAD-utstyr enklere og mer økonomisk å designe og produsere enn konvensjonelt LOCC-utstyr, mens reaksjonene stort sett er uavhengige og parallelliserte;men på grunn av den høye mekaniske styrken til sentrifugalutstyr, er tilgjengelig sponmateriale begrenset og små volumer er vanskelige.til bilen.Samtidig er de fleste LOAD-enheter designet for kun engangsbruk, noe som er dyrt for storskala deteksjon [96, 117, 118, 119].
De siste tiårene har LOAD, ansett som en av de mest lovende mikrofluidiske enhetene, fått betydelig oppmerksomhet fra forskere og produsenter.Dermed har LOAD fått bred aksept og har blitt brukt til molekylær diagnostikk av smittsomme patogener [120, 121, 122, 123, 124], spesielt under COVID-19-utbruddet.For eksempel, på slutten av 2020, Ji et al.[60] demonstrerte en direkte RT-qPCR-analyse for rask og automatisert parallell deteksjon av SARS-CoV-2 og influensa A og B-infeksjoner i svelgprøver.Deretter Xiong et al.[74] presenterte en LAMP-integrert diskoid mikrofluidisk plattform for rask, nøyaktig og samtidig påvisning av syv humane respiratoriske koronavirus, inkludert SARS-CoV-2, innen 40 minutter.Tidlig i 2021, de Oliveira et al.[73] demonstrerte en polystyren toner sentrifugal mikrofluidbrikke, manuelt betjent med en fingertupprotator, for RT-LAMP molekylær diagnose av COVID-19.Deretter har Dignan et al.[39] presenterte en automatisert bærbar sentrifugemikroenhet for rensing av SARS-CoV-2 RNA direkte fra bukkale vattpinnesnitt.Medved et al.[53] foreslo et innebygd SARS-CoV-2 aerosolprøvetakingssystem med en roterende mikrofluidisk fluorescerende brikke med lite volum med en deteksjonsgrense på 10 kopier/μL og en minimumssyklusterskel på 15 minutter.Suarez et al.[75] rapporterte nylig utviklingen av en integrert modulær sentrifugal mikrofluidisk plattform for direkte påvisning av SARS-CoV-2 RNA i varmeinaktiverte nasofaryngeale vattpinneprøver ved bruk av LAMP.Disse eksemplene viser de store fordelene og løftene til LOAD i molekylær diagnostikk av COVID-19.
I 1945 presenterte Muller og Clegg [125] først mikrofluidkanaler på papir ved bruk av filterpapir og parafin.I 2007 opprettet Whitesides-gruppen [126] den første funksjonelle papirplattformen for protein- og glukosetesting.Papir har blitt et ideelt substrat for mikrofluidikk.Papiret har iboende egenskaper som hydrofilisitet og porøs struktur, utmerket biokompatibilitet, lett vekt, fleksibilitet, brettbarhet, lav pris, brukervennlighet og bekvemmelighet.Klassiske µPAD-er består av hydrofile/hydrofobe strukturer bygget på papirsubstrater.Avhengig av den tredimensjonale strukturen kan μPAD-er deles inn i todimensjonale (2D) og tredimensjonale (3D) μPAD-er.2D µPADs produseres ved å danne hydrofobe grenser for å danne mikrofluidkanaler, mens 3D µPADs vanligvis er laget av stabler av lag med 2D mikrofluidisk papir, noen ganger ved papirbretting, slipteknikker, åpne kanaler og 3D-utskrift [96].Vandige eller biologiske væsker på μPAD er primært kontrollert av kapillærkraft uten en ekstern strømkilde, noe som letter forhåndslagring av reagenser, prøvehåndtering og multipleksdeteksjon.Nøyaktig flytkontroll og multipleksdeteksjon hemmes imidlertid av utilstrekkelig deteksjonshastighet, følsomhet og gjenbrukbarhet [96, 127, 128, 129, 130].
Som en uvanlig mikrofluidisk plattform har μPAD blitt bredt promotert og utviklet for molekylær diagnose av infeksjonssykdommer som HCV, HIV og SARS-CoV-2 [131, 132].For selektiv og sensitiv påvisning av HCV, Tengam et al.[133] utviklet en ny biosensor basert på fluorescerende papir ved bruk av en svært spesifikk nukleinsyreprobe basert på pyrrolidinylpeptid.Nukleinsyrer immobiliseres kovalent på delvis oksidert cellulosepapir ved reduktiv alkylering mellom aminogrupper og aldehydgrupper, og påvisning er basert på fluorescens.Disse signalene kan leses av en spesiallaget dings med et bærbart fluorescerende kamera i kombinasjon med et mobiltelefonkamera.Deretter har Lu et al.[134] designet en papirbasert fleksibel elektrode basert på nikkel/gull nanopartikler/karbon nanorør/polyvinylalkohol organometalliske rammesammensetninger for HIV-måldeteksjon ved DNA-hybridisering ved bruk av metylenblått som en DNA-redoksindikator.Mer nylig har Chowdury et al.[135] presenterte et hypotetisk plattformdesign for µPAD-testing på stedet ved bruk av rå pasientspytt i kombinasjon med LAMP og bærbar bildeteknologi for COVID-19 analyttdeteksjon.
Laterale strømningstester styrer væsker ved hjelp av kapillærkrefter og kontrollerer væskebevegelse ved fuktbarheten og egenskapene til porøse eller mikrostrukturerte substrater.Sidestrømsanordningene består av prøve, konjugat, inkubator og deteksjon, og absorberende puter.Nukleinsyremolekylene i LFA gjenkjenner spesifikke bindere som er forhåndslagret på bindingsstedet og binder seg som komplekser.Når væsken passerer gjennom inkubasjons- og deteksjonsplatene, fanges kompleksene opp av fangemolekylene som ligger på test- og kontrolllinjene, og viser resultater som kan leses direkte for det blotte øye.Vanligvis kan LFA gjennomføres på 2-15 minutter, noe som er raskere enn tradisjonell oppdagelse.På grunn av den spesielle mekanismen krever LFA få operasjoner og krever ikke tilleggsutstyr, noe som gjør den svært brukervennlig.Det er enkelt å produsere og miniatyrisere, og kostnadene for papirbaserte underlag er lavere.Den brukes imidlertid kun til kvalitativ analyse, og kvantitativ deteksjon er svært vanskelig, og multipleksingsevnen og gjennomstrømningen er svært begrenset, og bare én tilstrekkelig nukleinsyre kan påvises om gangen [96,110,127].
Selv om de fleste anvendelser av LFA er fokusert på immunoassays, er bruken av LFA for molekylær diagnostikk i mikrofluidiske brikker også effektiv og populær [136].I tilfelle av hepatitt B-virus, HIV og SARS-CoV-2 LFA Gong et al.[137] foreslo en oppkonverterende nanopartikkel-LFA-plattform og demonstrerte allsidigheten til denne miniatyriserte og bærbare plattformen gjennom sensitiv og kvantitativ påvisning av flere mål som HBV-nukleinsyre.I tillegg har Fu et al.[138] demonstrerte en ny LFA basert på overflateforsterket Raman-spektroskopi for kvantitativ analyse av HIV-1-DNA ved lave konsentrasjoner.For rask og sensitiv påvisning av SARS-CoV-2, Liu et al.[85] utviklet en mikrofluidisk integrert RPA lateral flowanalyse ved å kombinere RT-RPA og et universelt lateral flowdeteksjonssystem til et enkelt mikrofluidisk system.
Anvendelsen av ulike mikrofluidiske plattformer varierer avhengig av spesifikke studier, og drar full nytte av mulighetene og fordelene til plattformene.Med rimelige ventiler, pumper og kanaler er LOCC den mest omfattende plattformen for applikasjonsmangfold og interoperabilitet med størst rom for utvikling.Derfor håper og anbefaler vi at de nyeste studiene gjennomføres ved LOCC som et første forsøk og at forholdene optimaliseres.I tillegg forventes mer effektive og nøyaktige metoder å bli oppdaget og brukt i systemet.LOAD utmerker seg ved presis kontroll av væsker fra eksisterende LOCC-enheter og demonstrerer unike fordeler i enkeltdrev ved sentrifugalkraft uten behov for eksterne stasjoner, mens parallelle responser kan være separate og synkroniserte.Dermed vil LOAD i fremtiden bli den viktigste mikrofluidiske plattformen med færre manuelle operasjoner og mer modne og automatiserte teknologier.µPAD-plattformen kombinerer fordelene med LOCC og papirbaserte materialer for lavpris, engangsdiagnostikk.Derfor bør fremtidig utvikling fokusere på praktiske og veletablerte teknologier.I tillegg er LFA godt egnet for deteksjon med blotte øyne, og lover å redusere prøveforbruket og øke hastigheten på deteksjonen.En detaljert plattformsammenligning er vist i tabell 2.
Digitale analyser deler prøven inn i mange mikroreaktorer, som hver inneholder et diskret antall målmolekyler [139, 140].Digitale analyser gir betydelige fordeler for å utføre absolutt kvantifisering ved å utføre tusenvis av parallelle biokjemiske eksperimenter samtidig og individuelt i mikronskala rom i stedet for i en kontinuerlig fase.Sammenlignet med tradisjonell mikrofluidikk kan kammerreaksjoner redusere prøvevolumet, øke reaksjonseffektiviteten og enkelt integreres med andre analytiske metoder uten behov for kanaler, pumper, ventiler og kompakte design [141, 142, 143, 144, 145, 146, 147].Følgende to metoder brukes i digitale analyser for å oppnå ensartet og nøyaktig separasjon av løsninger, inkludert reagenser og prøver som celler, nukleinsyrer og andre partikler eller molekyler: (1) dråpeemulsjoner som utnytter væskegrensesnittsustabilitet;(2) array-deling utføres av enhetens geometriske begrensninger.I den første metoden kan dråper som inneholder reagenser og prøver i mikrokanaler lages ved passive metoder som medstrøm, kryssstrøm, strømningsfokusering, trinnvis emulgering, mikrokanalemulgering og membraner gjennom viskøse skjærkrefter og emulgering med kanalskifte.lokalisering [143, 145, 146, 148, 149] eller bruk av aktive metoder [150, 151], som introduserer ekstra energi gjennom elektrisk, magnetisk, termisk og mekanisk kontroll.I den sistnevnte tilnærmingen deles den beste væskevolumuniformiteten i mikrofluidiske kamre ved å holde romlige strukturer av samme størrelse, slik som mikrogroper og overflatematriser [152,153,154].Spesielt er dråper store strømningsseksjoner som også kan genereres og manipuleres på elektrodematriser basert på digital mikrofluidikk (DMF).Elektrovetting av dielektrikum er en av de best studerte DMF-teoriene, siden elektrofukting av dielektrikum tillater presis manipulering av individuelle dråper, kontrollerer formen på væsken og asymmetriske elektriske signaler som passerer gjennom forskjellige sider [141, 144].Hovedoperasjonene med dråper i DMF inkluderer sortering, splitting og sammenslåing [151, 155, 156], som kan brukes i ulike analysefelt, spesielt i molekylær deteksjon [157, 158, 159].
Digital nukleinsyredeteksjon er en tredjegenerasjons molekylær diagnostisk teknologi som følger konvensjonell PCR og kvantitativ sanntids-PCR (qPCR), parallelt med high-throughput-sekvensering og flytende biopsi.I løpet av de siste to tiårene har digitale nukleinsyrer utviklet seg raskt innen molekylær diagnostikk av smittsomme patogener [160, 161, 162].Absolutt kvantifisering av digital nukleinsyredeteksjon begynner med å pakke prøver og reagenser inn i individuelle rom for å sikre at hver målsekvens har samme sannsynlighet for å komme inn i hvert enkelt rom.Teoretisk kan hver seksjon tildeles flere målsekvenser, eller det kan ikke være et uavhengig mikroreaksjonssystem.Gjennom de ulike sansemekanismene beskrevet ovenfor kan rom med mikrobielle målsekvenser som genererer signaler over en viss terskel visualiseres med det blotte øye eller av en maskin og merkes som positive, mens andre rom som genererer signaler under terskelen merkes som positive .negative, som gjør signalet for hver seksjon til et boolsk.Ved å beregne antall opprettede rom og frekvensen av positive resultater etter reaksjonen, kan de originale kopiene av testprøvene matches ved hjelp av Poisson-fordelingsformelen uten behov for en standardkurve, som kreves for rutinemessige kvantitative analyser som f.eks. som qPCR.[163] Sammenlignet med tradisjonelle molekylære diagnostiske metoder har digital nukleinsyredeteksjon en høyere grad av automatisering, høyere analysehastighet og følsomhet, færre reagenser, mindre kontaminering og enklere design og produksjon.Av disse grunnene har bruken av digitale analyser, spesielt dråpebaserte metoder, for molekylær diagnostikk, som kombinerer amplifikasjons- og signalavlesningsteknikker, blitt godt studert under det kritiske utbruddet av SARS-CoV-2.For eksempel, Yin et al.[164] kombinerte digitale dråper og raske PCR-metoder for å oppdage ORF1ab-, N- og RNase P-genene i SARS-CoV-2 i en mikrofluidisk brikke.Spesielt var systemet i stand til å identifisere et positivt signal innen 115 sekunder, som er raskere enn konvensjonell PCR, noe som indikerer effektiviteten i punkt-av-omsorg deteksjon (Figur 7a).Dong et al.[165], Sow et al.[157], Chen et al.[166] og Alteri et al.[167] brukte også droplet digital PCR (ddPCR) for å oppdage SARS-CoV-2 i et mikrofluidsystem med imponerende resultater.For ytterligere å forbedre deteksjonshastigheten, Shen et al.[168] oppnådde ddPCR-basert chip-avbildning på så lite som 15 s uten bruk av bildestingteknikker, noe som fremskyndet ddPCR-teknologiprosessen fra laboratorium til applikasjon.Ikke bare termiske amplifikasjonsmetoder som PCR brukes, men også isotermiske amplifikasjonsmetoder brukes for å forenkle reaksjonsbetingelser og rask respons.Lu et al.[71] utviklet SlipChip for dråpeanalyse, i stand til å generere dråper av forskjellige størrelser ved høye tettheter i ett trinn og kvantifisere SARS-CoV-2-nukleinsyrer ved hjelp av digital LAMP (Figur 7b).Som en teknologi i rask utvikling, kan CRISPR også spille en viktig rolle i digital nukleinsyredeteksjon gjennom praktisk kolorimetrisk avbildning uten behov for ytterligere nukleinsyrefarging.Ackerman et al.utviklet en kombinatorisk matrisereaksjon for multipleksevaluering av nukleinsyrer.[158] oppdaget 169 human-assosierte virus, inkludert SARS-CoV-2, i dråper som inneholder CRISPR-Cas13-baserte nukleinsyredeteksjonsreagenser i en mikrobrønnanalyse (Figur 7c).I tillegg kan isotermisk forsterkning og CRISPR-teknologi brukes i samme system for å kombinere fordelene med begge.Park et al.[169] En CRISPR/Cas12a digital analyse ble utviklet i en kommersiell mikrofluidisk brikke for deteksjon av ekstrahert og varmedrept SARS-CoV-2 basert på en ett-trinns RT-RPA med en kortere og høyere signal-til-bakgrunn deteksjon tidsforhold., bredere dynamisk område og bedre følsomhet (fig. 7d).Noen beskrivelser av disse eksemplene er gitt i tabell 3.
Typisk digital plattform for deteksjon av nukleinsyre.a Den raske digitale PCR-arbeidsflyten består av fire nøkkeltrinn: prøvepreparering, distribusjon av reaksjonsblandingen, amplifikasjonsprosess og målkvantifisering (tilpasset fra [164]).b Skjematisk som viser analyse av SlipChip-dråper for dråpedannelse ved høy tetthet (tilpasset fra [71]).c CARMEN-Cas arbeidsflytdiagram13 (tilpasset fra [158]).d Oversikt over avansert digital virusdeteksjon med CRISPR/Cas i én pott (tilpasset fra [169]).Uten vann-i-olje, polydimetylsiloksan PDMS, PCR polymerasekjedereaksjon, DAQ datainnsamling, PID proporsjonal integrert derivat, CARMEN kombinatorisk matrisereaksjon for multipleks nukleinsyreevaluering, SARS-CoV-2, alvorlig akutt respiratorisk syndrom, coronavirus 2 , RT-amplifisering av revers transkriptase-rekombinase-polymerase-RPA, S/B-signal i bakgrunnen
Innleggstid: 15. september 2022
