Takk for at du besøker Nature.com.Nettleserversjonen du bruker har begrenset CSS-støtte.For den beste opplevelsen anbefaler vi at du bruker en oppdatert nettleser (eller deaktiverer kompatibilitetsmodus i Internet Explorer).I mellomtiden, for å sikre fortsatt støtte, vil vi gjengi nettstedet uten stiler og JavaScript.
Enzymatiske nærhetsmerkingsmetoder basert på aktiverte estere eller fenoksyradikaler er mye brukt for å kartlegge subcellulære proteomer og proteininteraktører i levende celler.Aktiverte estere er imidlertid mindre reaktive, noe som resulterer i en bred merkingsradius, og fenoksyradikaler generert ved peroksidbehandling kan forstyrre redoksveier.Her rapporterer vi en nærhetsmerkingsavhengig fotoaktiveringsmetode (PDPL) utviklet ved genetisk å koble miniSOG-fotosensibilisatorproteinet til et protein av interesse.Utløst av blått lys og kontrollert av eksponeringstid, genereres singlet oksygen og deretter spatiotemporalt oppløst merking av histidinrester av anilinproben.Vi demonstrerer dens høye kvalitet gjennom organellspesifikk proteomkartlegging.En side-ved-side sammenligning av PDPL med TurboID viser en mer spesifikk og omfattende proteomisk dekning av PDPL.Deretter brukte vi PDPL på den sykdomsassosierte transkripsjonskoaktivatoren BRD4 og E3 Parkin-ligase og fant tidligere ukjente interaktører.Ved overekspresjonsscreening ble to ukjente substrater, Ssu72 og SNW1, identifisert for Parkin, hvis nedbrytning er mediert av ubiquitinering-proteasomveien.
Nøyaktig karakterisering av proteinnettverk ligger til grunn for mange grunnleggende cellulære prosesser.Derfor vil svært nøyaktig spatiotemporal kartlegging av proteininteraksjoner gi et molekylært grunnlag for å dechiffrere biologiske veier, sykdomspatologi og forstyrre disse interaksjonene for terapeutiske formål.For dette formål er metoder som er i stand til å oppdage tidsmessige interaksjoner i levende celler eller vev svært ønskelig.Affinitetsrensingsmassespektrometri (AP-MS) har historisk blitt brukt til å identifisere bindingspartnere til proteiner av interesse (POI).Med utviklingen av kvantitative proteomikkmetoder ble Bioplex3.0 opprettet, den største databasen av proteinnettverk basert på AP-MS.Selv om AP-MS er veldig kraftig, er cellelyse- og fortynningstrinnene i arbeidsflyten forutsatt mot svake og forbigående bindingsinteraksjoner og introduserer artefakter etter lysis som falske interaksjonspar som mangler kompartmentalisering før lysering.
For å løse disse problemene er det utviklet unaturlige aminosyrer (UAA) med kryssbindingsgrupper og enzymatisk nærliggende merking (PL) (f.eks. APEX og BioID)5.Selv om UAA-metoden har blitt brukt i mange scenarier og gir informasjon om direkte proteinlim, er det fortsatt nødvendig med optimalisering av UAA-innsettingsstedet.Enda viktigere er det en støkiometrisk merkemetode som mangler en katalytisk reversering av merkingshendelser.Derimot smelter enzymatiske PL-metoder, slik som BioID-metoden, den konstruerte biotinligasen til POI7, som deretter aktiverer biotin for å danne et reaktivt biotinyl-AMP-estermellomprodukt.Enzymet katalyserer og frigjør dermed en aktivert biotin "sky" som merker proksimale lysinrester.BioID krever imidlertid mer enn 12 timer for å oppnå et tilstrekkelig merket signal, noe som utelukker bruk med tidsmessig oppløsning.Ved å bruke rettet evolusjon basert på gjærvisning, ble TurboID designet basert på BioID for å være mer effektiv, slik at effektiv merking med biotin innen 10 minutter, slik at mer dynamiske prosesser kan studeres.Fordi TurboID er svært aktiv og endogene biotinnivåer er tilstrekkelige for lavnivåmerking, blir bakgrunnsmerking et potensielt problem når sterkt forbedret og tidsbestemt merking kreves ved tilsetning av eksogent biotin.I tillegg er aktiverte estere dårlig reaktive (t1/2 ~5 min), noe som kan føre til en stor merkingsradius, spesielt etter metning av naboproteiner med biotin 5. I en annen tilnærming, genetisk fusjon av konstruert askorbatperoksidase (dvs. biotin- fenolradikaler og tillater proteinmerking innen ett minutt9, 10. APEX er mye brukt for å identifisere subcellulære proteomer, membranproteinkomplekser og cytosoliske signalproteinkomplekser 11, 12. Behovet for høye konsentrasjoner av peroksider kan imidlertid påvirke redoksproteiner eller -veier, og forstyrre cellulære prosesser.
Dermed vil en ny metode som er i stand til å generere mer reaktive merkede radius-undertrykkelsesarter med høy romlig og tidsmessig nøyaktighet uten å vesentlig forstyrre cellulære veier være et viktig tillegg til eksisterende metoder. Blant de reaktive artene vakte singlett oksygen vår oppmerksomhet på grunn av dens korte levetid og begrensede diffusjonsradius (t1/2 < 0,6 µs i celler)13. Blant de reaktive artene vakte singlett oksygen vår oppmerksomhet på grunn av dens korte levetid og begrensede diffusjonsradius (t1/2 < 0,6 µs i celler)13. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках)13. Blant de aktive formene vakte singlet oksygen vår oppmerksomhet på grunn av dens korte levetid og begrensede diffusjonsradius (t1/2 < 0,6 µs i celler)13.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 伕跳ﺬ伕跳ﺬ伕 µﺬ丨 1/2 < 0,6 µs）而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках). Blant aktive former tiltrekker singlet oksygen vår oppmerksomhet på grunn av dens korte levetid og begrensede diffusjonsradius (t1/2 < 0,6 μs i celler).Singlet oksygen er rapportert å tilfeldig oksidere metionin, tyrosin, histidin og tryptofan, noe som gjør det polar 14,15 for binding til amin- eller tiolbaserte prober16,17.Selv om singlet oksygen har blitt brukt til å merke subcellulært kompartment-RNA, forblir strategier for gjenbruk av endogene POI-nærhetsmarkører uutforsket.Her presenterer vi en plattform kalt photoactivation-dependent proximity labeling (PDPL), der vi bruker blått lys for å belyse POI-er smeltet sammen med en miniSOG-fotosensibilisator og utløse singlet-oksygengenerering for å oksidere proksimale rester, etterfulgt av aminholdige modifikasjoner for å oksidere kjemiske prober til mellomliggende levende celler..Vi testet en gruppe kjemiske prober for å maksimere tag-spesifisitet og identifiserte modifikasjonssteder ved å bruke en åpen proteomikk-arbeidsflyt.En side-ved-side sammenligning av PDPL med TurboID viser en mer spesifikk og omfattende proteomisk dekning av PDPL.Vi brukte denne tilnærmingen til organellspesifikke markører for det subcellulære proteomet og generell proteomidentifikasjon av bindingspartnere for det kreftassosierte epigenetiske regulatoriske proteinet BRD4 og Parkinsons sykdomsassosierte E3-ligase Parkin, som bekreftet både et kjent og et ukjent nettverk av proteiner. interaksjoner..Evnen til PDPL til å gjenkjenne E3-substrater i store proteinkomplekser representerer en situasjon der gjenkjennelse av indirekte bindemidler er nødvendig.To ukjente parkinsubstrater mediert av ubiquitination-proteasom har blitt bekreftet in situ.
Fotodynamisk terapi (PDT)19 og kromoforassistert laserinaktivering (CALI)20, der lysbestråling med fotosensibilisatorer genererer singlett oksygen, kan inaktivere målproteiner eller forårsake celledød.Siden singlett oksygen er et svært reaktivt stoff med en teoretisk diffusjonsavstand på ca. 70 nm, kan romlig begrenset oksidasjon rundt fotosensibilisatoren kontrolleres.Basert på dette konseptet bestemte vi oss for å bruke singlet oksygen for å oppnå tett merking av proteinkomplekser i levende celler.Vi har utviklet en PDPL kjemoproteomisk tilnærming for å oppfylle fire funksjoner: (1) å katalysere generering av aktivt singlet oksygen som ligner på PL enzymatiske tilnærming;(2) gi tidsbestemt merking ved lysinitiering;(3) ved endring (4) Unngå å bruke endogene kofaktorer (som biotin) for å redusere bakgrunn, eller bruk svært forstyrrende eksogene reagenser (som peroksider) for å minimere celleeksponering for miljøstress.
Fotosensibilisatorer kan deles inn i to kategorier, inkludert fluoroforer med liten molekylvekt (f.eks. rose bengal, metylenblått)22 og genetisk kodede små proteiner (f.eks. miniSOG, KillerRed)23.For å oppnå en modulær design utviklet vi den første generasjons PDPL-plattformen ved å legge til fotosensibiliserende (PS) proteiner til POI24,25 (Figur 1a).Når det bestråles med blått lys, oksiderer singlett oksygen proksimale nukleofile aminosyrerester, noe som resulterer i en umpolung polaritet som er elektrofil og kan reagere ytterligere med aminprobenukleofile16,17.Proben er designet med et alkynhåndtak for å tillate klikkkjemi og trekke ned for LC/MS/MS-karakterisering.
Skjematisk illustrasjon av merking av proteinkomplekser mediert av miniSOG.Når de utsettes for blått lys, genererer celler som uttrykker miniSOG-POI singlet oksygen, som modifiserer interagerende proteiner, men ikke ikke-bindende proteiner.Mellomprodukter av fotooksidasjon blir fanget opp av relémerker av den aminkjemiske sonden for å danne kovalente addukter.Alkynylgruppen på kjemiproben tillater klikkkjemi for berikelse ved nedtrekk etterfulgt av LC-MS/MS kvantifisering.b Kjemisk struktur av aminprober 1-4.c Representativ fluorescerende gelanalyse av mitokondrielle lokaliserte miniSOG-medierte proteomiske markører ved bruk av prober 1-4 og relativ kvantifisering basert på geldensitometri.Signal-til-bakgrunnsforholdet til kjemiske prober ble vurdert ved bruk av negative kontrolleksperimenter som ekskluderte blått lys eller ved bruk av HEK293T-celler uten miniSOG-ekspresjon.n = 2 biologisk uavhengige prøver.Hver prikk representerer en biologisk kopi.d Representativ påvisning og kvantifisering av PDPL ved bruk av optimalisert probe 3 i nærvær eller fravær av de angitte PDPL-komponentene som c.n = 3 biologisk uavhengige prøver.Hver prikk representerer en biologisk kopi.Senterlinjer og værhår representerer gjennomsnittet og ± standardavviket.CBB: Coomassie Brilliant Blue.e Konfokal avbildning av singlett oksygen med langt rød Si-DMA-flekk.Målestokk: 10 µm.Gelavbildning og konfokale eksperimenter ble uavhengig gjentatt minst to ganger med lignende resultater.
Vi testet først evnen til de modne fotosensibilisatorene miniSOG26 og KillerRed23, stabilt uttrykt i HEK293T, til å mediere propargylaminmerking av proteomet som en kjemisk probe (tilleggsfigur 1a).Gelfluorescensanalyse viste at merking av hele proteomer ble oppnådd ved bruk av miniSOG og bestråling med blått lys, mens det ikke ble observert noe synlig merkeprodukt med KillerRed.For å forbedre signal-til-bakgrunn-forholdet testet vi deretter et sett med kjemiske prober som inneholdt anilin (1 og 3), propylamin (2) eller benzylamin (4).Vi observerte at HEK293T-celler selv hadde et høyere bakgrunnssignal sammenlignet med ingen blått lys, muligens på grunn av den endogene riboflavin-fotosensibilisatoren, flavinmononukleotid (FMN) 27 . Anilinbaserte kjemiske prober 1 og 3 ga bedre spesifisitet, med HEK293T som stabilt uttrykker miniSOG i mitokondrier som viser en >8 ganger økning i signal for probe 3, mens probe 2 brukt i RNA-merkingsmetoden CAP-seq kun viser ~2,5- fold signaløkning, sannsynligvis på grunn av ulike reaktivitetspreferanser mellom RNA og protein (fig. 1b, c). Anilinbaserte kjemiske prober 1 og 3 ga bedre spesifisitet, med HEK293T som stabilt uttrykker miniSOG i mitokondrier som viser en >8 ganger økning i signal for probe 3, mens probe 2 brukt i RNA-merkingsmetoden CAP-seq kun viser ~2,5- fold signaløkning, sannsynligvis på grunn av ulike reaktivitetspreferanser mellom RNA og protein (fig. 1b, c).Anilinbaserte kjemiske prober 1 og 3 viste bedre spesifisitet: HEK293T, som stabilt uttrykker miniSOG i mitokondrier, viser mer enn en 8 ganger økning i signal for probe 3, mens probe 2, brukt i CAP-seq RNA-merkingsmetoden, kun viser ~2,5 ganger signaløkning, sannsynligvis på grunn av ulike reaktivitetspreferanser mellom RNA og protein (fig. 1b, c).° 2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c）。基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 的 特异性 ， HEK293T 在 粒体 中 稳定 表达 表达 Minisog ， 3 的 信号 增加 增加> 8 倍 而 于 于 RNA 标记 CAP-EQ 的 2 ~ ~ ~ ~ 2,5 -倍信号增加，可能是由于RNAAnilinbaserte kjemiske prober 1 og 3 hadde bedre spesifisitet, HEK293T uttrykte stabilt miniSOG i mitokondrier, og probe 3 hadde over 8 ganger økning i signal, mens probe 2 for CAP-seq RNA-merkingsmetoden viste bare ~2,5 ganger økning.i signalet, sannsynligvis på grunn av ulike reaksjonspreferanser mellom RNA og protein (fig. 1b, c).I tillegg ble probe 3 isomerer og hydrazinprober (prober 5, 6, 7) testet, og bekreftet optimaliseringen av probe 3 (tilleggsfigur 1b,c).Tilsvarende avslørte in-gel fluorescensanalyse andre optimaliserte eksperimentelle parametere: bestrålingsbølgelengde (460 nm), kjemisk probekonsentrasjon (1 mM) og bestrålingstid (20 min) (tilleggsfigur 2a–c).Å utelate noen komponent eller trinn i PDPL-protokollen resulterte i betydelig signalreversering til bakgrunnen (fig. 1d).Spesielt ble proteinmerking betydelig redusert i nærvær av natriumazid eller trolox, som er kjent for å slukke singlet oksygen.Tilstedeværelsen av D2O, som er kjent for å stabilisere singlet oksygen, forbedrer merkesignalet.For å undersøke bidraget fra andre reaktive oksygenarter til merking, ble mannitol og vitamin C tilsatt for å etablere henholdsvis hydroksyl- og superoksidradikalfangere, 18, 29, men de ble ikke funnet å redusere merking.Tilsetning av H2O2, men ikke belysning, resulterte ikke i merking (Supplerende Fig. 3a).Fluorescens-singlet oksygenavbildning med Si-DMA-prober bekreftet tilstedeværelsen av singlett oksygen i HEK293T-miniSOG-ledningen, men ikke i den originale HEK293T-ledningen.I tillegg kunne ikke mitoSOX Red oppdage superoksidproduksjon etter belysning (fig. 1e og tilleggsfig. 3b) 30. Disse dataene tyder sterkt på at singlett oksygen er den viktigste reaktive oksygenarten som er ansvarlig for påfølgende proteomisk merking.Cytotoksisitet av PDPL ble vurdert inkludert blålysbestråling og kjemiske prober, og ingen signifikant cytotoksisitet ble observert (tilleggsfig. 4a).
For å studere merkemekanismen og muliggjøre proteomisk identifikasjon av proteinkomplekser ved bruk av LC-MS/MS, må vi først bestemme hvilke aminosyrer som er modifisert og deltamassen til probemerker.Metionin, histidin, tryptofan og tyrosin er rapportert å være modifisert av singlett oksygen14,15.Vi integrerer TOP-ABPP31-arbeidsflyten med det objektive åpne søket fra FragPipe-dataplattformen basert på MSFragger32.Etter singlet oksygenmodifisering og kjemisk probemerking, ble klikkkjemi utført ved bruk av en biotinreduksjonsetikett inneholdende en spaltbar linker, etterfulgt av neutravidin-strekking og trypsinfordøyelse.Det modifiserte peptidet, fortsatt bundet til harpiksen, ble fotospaltet for LC-MS/MS-analyse (figur 2a og tilleggsdata 1).Et stort antall modifikasjoner skjedde i hele proteomet med over 50 peptidkart (PSM)-treff oppført (fig. 2b).Overraskende nok observerte vi bare modifikasjon av histidin, sannsynligvis på grunn av den høyere reaktiviteten til oksidert histidin mot anilinprober enn andre aminosyrer.I henhold til den publiserte mekanismen for histidinoksidasjon med singlett oksygen,21,33 tilsvarer den foreslåtte delta-massestrukturen på +229 Da adduktet av probe 3 med 2-oksohistidin etter to oksidasjoner, mens +247 Da er hydrolyseproduktet av +229 Da (Supplerende Fig. 5).Evalueringen av MS2-spekteret viste en høy pålitelighet av identifisering av de fleste y- og b-ioner, inkludert identifisering av modifiserte fragmentioner (y og b) (fig. 2c).Kontekstanalyse av den lokale sekvensen til PDPL-modifiserte histidiner avslørte en moderat motivpreferanse for små hydrofobe rester ved ±1 posisjoner (tilleggsfigur 4b).I gjennomsnitt ble 1,4 histidiner identifisert per protein, og stedene til disse markørene ble bestemt ved løsningsmiddeltilgjengelig overflateareal (SASA) og relativ løsningsmiddeltilgjengelighet (RSA) analyse (tilleggsfigur 4c,d).
En objektiv arbeidsflyt for å studere gjenværende selektivitet ved å bruke FragPipe-databehandlingsplattformen drevet av MSFragger.Spaltbare linkere brukes i Click-kjemi for å tillate fotospalting av modifiserte peptider fra streptavidinharpiks.Et åpent søk ble satt i gang for å identifisere en rekke modifikasjoner, samt relevante rester.b Tilordne massen av modifikasjoner som skjer gjennom hele proteomet.Peptidkartlegging PSM.c MS2 spektral annotering av histidinseter modifisert med probe 3. Som et representativt eksempel, en kovalent reaksjon med probe 3 tilførte +229,0938 Da til den modifiserte aminosyren.d Mutasjonsanalyse brukt til å teste for PDPL-markører.PRDX3 (H155A, H225A) og PRDX1 (H10A, H81A, H169A) ble transfektert med villtypeplasmider for anti-Flag-deteksjon.e Det syntetiske peptidet ble reagert med renset miniSOG i nærvær av probe 3 og de tilsvarende produktene med Δm +247 og +229 ble notert i LC-MS-spekteret.f In vitro protein-til-protein-interaksjoner modellert med miniSOG-6xHis-tag og anti-6xHis-antistoff.Antibiotin (streptavidin-HRP) og anti-mus Western blot-analyse av miniSOG-6xHis/anti-6xHis antistoffkomplekser merket med probe 3, avhengig av eksponeringstidspunktet for lys.Etiketter for individuelle proteiner er uttrykt i den tilsvarende molekylvekten: LC antistoff lett kjede, HC antistoff tung kjede.Disse eksperimentene ble uavhengig gjentatt minst to ganger med lignende resultater.
For biokjemisk verifisering av merkestedet ble PRDX3 og PRDX1 identifisert ved massespektrometri endret fra histidin til alanin og sammenlignet med villtype i transfeksjonsanalyser.PDPL-resultatene viste at mutasjonen reduserte merkingen betydelig (fig. 2d).I mellomtiden ble peptidsekvensene identifisert i det åpne søket syntetisert og reagert in vitro med renset miniSOG i nærvær av probe 3 og blått lys, noe som ga produkter med et masseskift på +247 og +229 Da når de ble oppdaget av LC-MS (fig. 2e).).For å teste om interagerende proksimale proteiner kunne merkes in vitro som respons på miniSOG-fotoaktivering, designet vi en kunstig nærhetsanalyse ved interaksjon mellom miniSOG-6xHis-proteinet og et anti-His monoklonalt antistoff in vitro (Figur 2f).I denne analysen forventet vi proksimal merking av antistoffets tunge og lette kjeder med miniSOG.Faktisk viste anti-mus (som gjenkjente de tunge og lette kjedene til anti-6xHis-merket antistoff) og streptavidin Western blotter sterk biotinylering av de tunge og lette kjedene.Spesielt la vi merke til miniSOG-autobiotinylering på grunn av 6xHis-taggen og tverrbindinger mellom lette og tunge kjeder, som kan være relatert til det tidligere beskrevne gapet mellom lysin og 2-okso-histidin proksimal respons.Avslutningsvis konkluderer vi med at PDPL modifiserer histidin på en nærhetsavhengig måte.
Vårt neste mål var å karakterisere det subcellulære proteomet for å teste spesifisiteten til in situ merking.Derfor uttrykte vi miniSOG stabilt i kjernen, mitokondriell matrise eller ytre ER-membran til HEK293T-celler (fig. 3a).Gelfluorescensanalyse avslørte rikelig med merkede bånd på tre subcellulære steder, så vel som forskjellige merkingsmønstre (fig. 3b).Fluorescensavbildningsanalyse viste høy spesifisitet av PDPL (fig. 3c).PDPL-arbeidsflyten ble fulgt av klikkreaksjoner med rhodaminfargestoffer for å avgrense subcellulære proteomer ved bruk av fluorescensmikroskopi, og PDPL-signaler ble kolokalisert med DAPI, mitokondrielle sporere eller ER-sporere, noe som bekrefter PDPLs høyverdighet.For de tre organellelokasjonene viste en side-ved-side sammenligning av PDPL med TurboID ved bruk av avidin western blot at PDPL ble merket mer spesifikt sammenlignet med deres respektive kontroller.Under PDPL-forhold dukket det opp flere merkede bånd, noe som indikerer flere PDPL-merkede proteiner (tilleggsfigur 6a-d).
en skjematisk representasjon av miniSOG-mediert organellspesifikk proteommerking.miniSOG retter seg mot mitokondriematrisen via fusjon til de N-terminale 23 aminosyrene til human COX4 (mito-miniSOG), kjernen via fusjon til H2B (nucleus-miniSOG), og Sec61β via den cytoplasmatiske siden av ER-membranen (ER-miniSOG) ).Indikasjoner inkluderer gelavbildning, konfokal avbildning og massespektrometri.b Representative gelbilder av tre organellspesifikke PDPL-profiler.CBB Coomassie Brilliant Blue.c Representative konfokale bilder av HEK293T-celler som stabilt uttrykker miniSOG med forskjellige subcellulære lokaliseringer påvist av antistoff merket V5 (rød).Subcellulære markører brukes for mitokondrier og ER (grønn).PDPL arbeidsflyten inkluderer påvisning av miniSOG (gul) merkede subcellulære proteomer ved bruk av Cy3-azid klikkkjemi.Målestokk: 10 µm.d Vulkaniske plott av PDPL-merkede proteomer i forskjellige organeller kvantifisert ved umerket kvantifisering (n = 3 uavhengige biologiske eksperimenter).Two-tailed Student's t-test ble brukt på vulkantomter.HEK293T villtype ble brukt som negativ kontroll. Betydelig endrede proteiner er uthevet i rødt (p < 0,05 og >2 ganger ioneintensitetsforskjell). Betydelig endrede proteiner er uthevet i rødt (p < 0,05 og >2 ganger ioneintensitetsforskjell). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 og >2-кратная разница в интенсивности ионов). Betydelig endrede proteiner er uthevet i rødt (p < 0,05 og >2 ganger forskjell i ioneintensitet).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）.显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 og > 2-кратная разница в ионной силе). Betydelig endrede proteiner er uthevet i rødt (p < 0,05 og > 2 ganger forskjell i ionestyrke).Beslektede proteiner som er viktige for HEK293T-miniSOG, men ikke viktige for HEK293T, er vist i grønt.e Analyse av spesifisiteten til proteomiske datasett fra eksperimenter d.Det totale antallet statistisk signifikante proteiner i hver organell (røde og grønne prikker) er markert øverst.Histogrammer viser proteiner lokalisert i organeller basert på MitoCarta 3.0, GO-analyse og A. Ting et al.mennesker.Separate datasett for mitokondrier, kjerner og ER.Disse eksperimentene ble uavhengig gjentatt minst to ganger med lignende resultater.Rådata leveres i form av rådatafiler.
Oppmuntret av gel- og bilderesultatene ble etikettfri kvantifisering brukt for å kvantifisere det identifiserte proteomet i hver organell (tilleggsdata 2).Utransfektert HEK293T ble brukt som en negativ kontroll for å trekke fra bakgrunnsmarkører. Vulkanplottanalyse viste betydelig berikede proteiner (p < 0,05 og >2 ganger ioneintensitet) samt singletonproteiner som bare er tilstede i miniSOG-uttrykkende linjer (fig. 3d røde og grønne prikker). Vulkanplottanalyse viste betydelig berikede proteiner (p < 0,05 og >2 ganger ioneintensitet) samt singletonproteiner som bare er tilstede i miniSOG-uttrykkende linjer (fig. 3d røde og grønne prikker). Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). Vulkanplottanalyse viste signifikant berikede proteiner (p<0,05 og >2 ganger ioneintensitet) så vel som enkeltproteiner som kun er tilstede i miniSOG-uttrykkende linjer (fig. 3d, røde og grønne prikker).火山图分析显示出显着富集的蛋白质（p < 0.05 和>2 倍离子强度）以及仅存在于miniSOG 表达系中的单一蛋白质（图3d 红色和绿色点）。火山图 分析 显示 出 显着 的 蛋白质 （p <0.05 和> 2 倍 离子 强度） 仅 存 在于 在于 minisog 表达 系 的 单一 蛋白质 （图 3d 红色 绿色点。。。）））））））））） Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). Vulkanplottanalyse avslørte betydelig berikede proteiner (p<0,05 og >2x ionestyrke) samt enkeltproteiner som kun er tilstede i miniSOG-ekspresjonslinjen (røde og grønne prikker i fig. 3d).Ved å kombinere disse dataene identifiserte vi henholdsvis 1364, 461 og 911 statistisk signifikante kjernefysiske, mitokondrielle og ER ytre membranproteiner.For å analysere nøyaktigheten av organell-lokalisert PDPL, brukte vi MitoCarta 3.0, Gene Ontology (GO) analyse, og A. Ting et al.et datasett8 ble brukt for mitokondrier, kjerne og ER for å teste organellspesifisiteten til de påviste proteinene, tilsvarende en nøyaktighet på 73,4, 78,5 og 73,0 % (fig. 3e).Spesifisiteten til PDPL bekrefter at PDPL er et ideelt verktøy for å identifisere organellspesifikke proteomer.Spesielt viste submitokondriell analyse av identifiserte mitokondrielle proteiner at det fangede proteomet hovedsakelig var fordelt i matrisen og indre membran (henholdsvis 226 og 106), og utgjorde 91,7% (362) av det totale antallet identifiserte mitokondrielle proteiner.et høyt nivå av PDPL ble i tillegg bekreftet (tilleggsfigur 7a).På samme måte viste subnukleær analyse at det fangede proteomet hovedsakelig var fordelt i kjernen, nukleoplasmaet og nukleolen (tilleggsfigur 7b).Kjernefysisk proteomisk analyse med et kjernefysisk lokaliseringssignalpeptid (3xNLS) viste lignende nøyaktighet som H2B-konstruksjonen (tilleggsfig. 7c–h).For å bestemme spesifisiteten til PDPL-markøren ble kjernefysisk laminin A valgt som en mer diskret lokalisert POI7-felle.PDPL identifiserte 36 signifikant berikede proteiner, hvorav 12 proteiner (30,0 % inkludert lamin A) var godt karakteriserte lamin A-interagerende proteiner annotert av String-databasen, med en høyere prosentandel enn BioID-metoden (122 proteiner) 28 av 28. , 22.9 %) 7. Vår metode identifiserte færre proteiner, muligens på grunn av begrensede merkeområder, noe som ble muliggjort av mer aktivt singlet oksygen.GO-analyse viste at de identifiserte proteinene hovedsakelig var lokalisert i nukleoplasma (26), nukleær membran (10), nukleær membran (9) og nukleære porer (5).Til sammen utgjorde disse kjernefysisk lokaliserte proteinene 80 % av de berikede proteinene, noe som ytterligere demonstrerer spesifisiteten til PDPL (tilleggsfigur 8a–d).
Etter å ha etablert evnen til PDPL til å utføre nærhetsmerking i organeller, testet vi om PDPL kunne brukes til å analysere POI-bindingspartnere.Spesielt forsøkte vi å definere PDPL-analyse av cytosoliske proteiner, som anses som vanskeligere mål enn deres membranlokaliserte motparter på grunn av deres svært dynamiske natur.Bromodomain og extraterminal (BET) protein BRD4 har tiltrukket seg vår oppmerksomhet for sin nøkkelrolle i ulike sykdommer 35, 36.Komplekset dannet av BRD4 er en transkripsjonell koaktivator og et viktig terapeutisk mål.Ved å regulere uttrykket av c-myc og Wnt5a transkripsjonsfaktorer, antas BRD4 å være en nøkkeldeterminant for akutt myeloid leukemi (AML), multippelt myelom, Burkitts lymfom, tykktarmskreft og inflammatoriske sykdommer37,38.I tillegg retter noen virus seg mot BRD4 for å regulere viral og cellulær transkripsjon, slik som papillomavirus, HIV og SARS-CoV-236,39.
For å kartlegge BRD4-interaksjonen ved bruk av PDPL, kombinerte vi miniSOG med en kort N- eller C-terminal isoform av BRD4.Proteomiske resultater avslørte en høy grad av overlapping mellom de to konstruksjonene (tilleggsfigur 9a).Det kjernefysiske proteomet identifisert med miniSOG-H2B dekker 77,6 % av proteinene som interagerer med BRD4 (Supplerende Fig. 9b).Deretter ble forskjellige tidspunkter for belysning (2, 5, 10, 20 min) brukt for å justere markørradiusen (fig. 4a og tilleggsdata 3).Vi konkluderer med at ved kortere fotoperioder vil PDPL primært merke direkte bindingspartnere, mens lengre perioder vil inkludere proteiner identifisert under kortere fotoaktiveringsperioder, så vel som indirekte mål i merkingskomplekser.Faktisk fant vi sterk overlapping mellom tilstøtende tidspunkter (84,6 % i 2 og 5 min; 87,7 % i 5 og 10 min; 98,7 % i 10 og 20 min) (Fig. 4b og Supplerende Fig. 9c).I alle eksperimentelle grupper fant vi ikke bare BRD4-selvmerking, men flere kjente mål som MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A og HMGB1 kommentert i strengdatabasen.Ionestyrken til disse målene er proporsjonal med eksponeringstiden (fig. 4c og tilleggsfig. 9d).GO-analyse av proteinene identifisert i 2-minutters gruppen viste at de identifiserte proteinene var lokalisert i kjernen og var involvert i kromatinremodellering og RNA-polymerasefunksjon.Den molekylære funksjonen til proteinet ble beriket i kromatinbinding eller transkripsjonell koaktivering, i samsvar med BRD4-funksjonen (fig. 4d).Strengedatabaseaktivert proteininteraksjonsanalyse avslørte et første nivå av indirekte interaksjoner mellom BRD4- og HDAC-familieinteraksjonskomplekser som SIN3A, NCOR2, BCOR og SAP130 (fig. 4e og tilleggsfig. 9e), i samsvar med BRD4- og HDAC-bindende acetylerte histoner ..I tillegg ble representative mål identifisert av LC-MS/MS, inkludert Sin3A, NSUN2, Fus og SFPQ, bekreftet ved Western blotting (fig. 4f).Nylig har den korte isoformen av BRD4 blitt rapportert å danne kjerner med væske-væskefaseseparasjonsegenskaper (LLPS).De RNA-bindende proteinene Fus og SFPQ formidler LLPS av forskjellige cellulære prosesser og er her blitt identifisert som uregistrerte BRD4-bindende proteiner.Interaksjonen mellom BRD4 og SFPQ ble bekreftet av co-immunopresipitering (co-IP) eksperimenter (figur 4g), noe som antyder en annen mekanisme for BRD4-mediert væske-væskefaseseparasjon som fortjener videre undersøkelse.Til sammen antyder disse resultatene at PDPL er en ideell plattform for å identifisere kjente BRD4-interagerende så vel som ukjente bindende proteiner.
en skjematisk representasjon av miniSOG-mediert BRD4 nærhetsmarkering, eksponeringstider: 2, 5, 10 og 20 min.b Overlapping av proteiner identifisert ved forskjellige belysningstidspunkter.Proteinberikelse identifisert i HEK293T-miniSOG-BRD4 var statistisk signifikant sammenlignet med villtype HEK293T.c Ioneintensitet ved kvantifisering av umerkede representative kjente BRD4-bindende proteiner i løpet av den angitte eksponeringstiden.n = 3 biologisk uavhengige prøver.Data presenteres som gjennomsnitt ± standardavvik.d Genontologisk analyse (GO) av proteiner identifisert i 2-minutters gruppen.De ti første GO-begrepene er oppført.Bobler er farget i henhold til GO-termkategorien, og boblestørrelsen er proporsjonal med antall proteiner som finnes i hvert ledd.e Strengeanalyse av proteiner som interagerer med BRD4.De gule sirklene er direkte lim og de grå sirklene er det første laget med indirekte lim.De røde linjene representerer de eksperimentelt bestemte interaksjonene og de blå linjene representerer de forutsagte interaksjonene.f Representative BRD4-bindingsmål identifisert i LC-MS/MS ble verifisert ved Western blotting.g Co-immunutfellingseksperimenter bekrefter interaksjonen mellom SFPQ og BRD4.Disse eksperimentene ble uavhengig gjentatt minst to ganger med lignende resultater.Rådata leveres i form av rådatafiler.
I tillegg til å identifisere uregistrerte POI-assosierte mål, antar vi at PDPL vil være egnet for å identifisere substrater for enzymer, noe som vil kreve karakterisering av indirekte bindende proteiner i store komplekser for å kommentere uregistrerte substrater.Parkin (kodet av PARK2) er en E3-ligase og mutasjoner i parkin er kjent for å forårsake autosomal recessiv juvenil Parkinsons sykdom (AR-JP)42.I tillegg har parkin blitt beskrevet som essensielt for mitofagi (mitokondriell autofagi) og fjerning av reaktive oksygenarter.Men selv om flere parkinsubstrater er identifisert, er rollen til parkin i denne sykdommen fortsatt uklar.For å kommentere dets ukarakteriserte underlag ble PDPL testet ved å legge til miniSOG til N- eller C-terminalen av parkin.Celler ble behandlet med karbonylcyanid-protontransportøren m-klorfenylhydrazon (CCCP) for å aktivere parkin via PINK1-Parkin-veien.Sammenlignet med våre BRD4 PDPL-resultater, avslørte parkin N-terminus fusjon et større sett med målproteiner, selv om det dekket en større del av C-terminalen (177 av 210) (figur 5a,b og tilleggsdata 4).Resultatet stemmer overens med rapporter om at N-terminale tagger kan avvikende aktivere Parkin44.Overraskende nok var det bare 18 overlappende proteiner i våre data med publiserte AP-MS-resultater for Parkin43, sannsynligvis på grunn av forskjeller mellom cellelinjer og proteomikk-arbeidsflyter.I tillegg til fire kjente proteiner (ARDM1, HSPA8, PSMD14 og PSMC3) identifisert ved to metoder (fig. 5c)43.For ytterligere å validere resultatene av LC-MS/MS, ble PDPL-behandling og påfølgende Western blotting brukt for å sammenligne resultatene av HEK293T foreldrecelleanalysen og den stabile N-terminale parkinlinjen.Tidligere ukjente mål CDK2, DUT, CTBP1 og PSMC4 ble testet med et kjent bindemiddel, DNAJB1 (fig. 5d).
Vulkanplott av parkin-interagerende proteiner i HEK293T-celler med stabilt uttrykt miniSOG fusjonert til N- eller C-terminalen av parkin (n = 3 uavhengige biologiske eksperimenter).Two-tailed Student's t-test ble brukt på vulkantomter.HEK293T ble brukt som negativ kontroll. Betydelig endrede proteiner er uthevet i rødt (p < 0,05 og >2 ganger ioneintensitetsforskjell). Betydelig endrede proteiner er uthevet i rødt (p < 0,05 og >2 ganger ioneintensitetsforskjell). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 og >2-кратная разница в интенсивности ионов). Betydelig endrede proteiner er uthevet i rødt (p < 0,05 og >2 ganger forskjell i ioneintensitet).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）.显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 og > 2-кратная разница в ионной силе). Betydelig endrede proteiner er uthevet i rødt (p < 0,05 og > 2 ganger forskjell i ionestyrke).Beslektede proteiner som er viktige for HEK293T-miniSOG, men ikke viktige for HEK293T, er vist i grønt.b Venn-diagram som viser overlappende proteiner mellom N-terminale og C-terminale konstruksjoner.N-terminale tagger kan avvikende aktivere parkin og resultere i mer gjenkjennelige proteiner.c Venn-diagram som viser overlappende proteiner mellom PDPL og AP-MS.Kjente interaktører er oppført, inkludert 4 av 18 overlappende proteiner og 11 av 159 proteiner spesifikt identifisert i PDPL.d Representative mål identifisert av LC-MS/MS ble verifisert ved Western blotting.e Ssu72 og SNW1 ble identifisert som uregistrerte parkinsubstrater.Disse FLAG-merkede proteinplasmidene ble transfektert inn i HEK293T og HEK293T-Parkin-miniSOG etterfulgt av CCCP-behandling på forskjellige tidspunkter.Nedbrytningen var mer uttalt i Parkin-overekspresjonslinjen.f Ved å bruke proteasomhemmeren MG132 ble det bekreftet at nedbrytningsprosessen til Ssu72 og SNW1 er mediert av proteasom-ubiquitinering.Disse eksperimentene ble uavhengig gjentatt minst to ganger med lignende resultater.Rådata leveres i form av rådatafiler.
Spesielt må proteinene identifisert av PDPL inkludere parkinbindende proteiner og deres substrater.For å oppdage uregistrerte parkinsubstrater valgte vi syv identifiserte proteiner (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 og SNW1) og transfekterte plasmider for å eksponere disse genene for normal HEK293T og stabilt uttrykke miniSOG-Parkins behandling etterfulgt av HEK293T.Nivåene av Ssu72- og SNW1-proteiner ble betydelig redusert i den stabile miniSOG-Parkin-linjen (fig. 5e).Behandling med CCCP i 12 timer resulterte i den mest signifikante nedbrytningen av begge substratene.For å undersøke om nedbrytningen av Ssu72 og SNW1 er regulert av proteasom-ubiquitinering, ble proteasomhemmeren MG132 tilsatt for å hemme proteasomaktiviteten, og faktisk fant vi at deres nedbrytningsprosess ble hemmet (fig. 5f).Ytterligere ikke-substratmål ble bekreftet som Parkin-interaktorer ved bruk av Western blotting (Supplerende Fig. 10), som viste konsistente resultater med LC-MS/MS.Avslutningsvis tillater integreringen av PDPL-arbeidsflyten med målproteintransfeksjonsverifisering identifisering av uregistrerte E3-ligasesubstrater.
Vi har utviklet en felles plattform for nærhetsmerking som lar deg identifisere interessepunkter som samhandler i rom og tid.Plattformen er basert på miniSOG-fotosensibilisatorproteinet, som bare er omtrent 12 kDa, mindre enn halvparten av størrelsen på det modne APEX2-enzymet (27 kDa) og en tredjedel av størrelsen på TurboID (35 kDa).Den mindre størrelsen bør i stor grad utvide spekteret av applikasjoner for å studere små proteininteraktomer.Ytterligere utforskning av ytterligere fotosensibilisatorer, enten det er genetisk kodede proteiner eller små molekyler, er nødvendig for å øke kvanteutbyttet av singlett oksygen og utvide følsomheten til denne tilnærmingen.For gjeldende versjon av miniSOG kan høy tidsoppløsning oppnås ved å bruke blå belysning for å aktivere nærhetsmarkører.I tillegg frigjorde lengre eksponeringstid en større "sky" av singlett oksygen, noe som resulterte i modifisering av mer distale histidinrester, økt merkingsradius og evnen til å finjustere PDPL romlig oppløsning.Vi testet også syv kjemiske prober for å øke signal-til-bakgrunnsforholdet og utforsket den molekylære mekanismen bak denne tilnærmingen.TOP-ABPP-arbeidsflyten kombinert med objektivt åpent søk bekreftet at modifikasjoner bare skjedde i histidiner og ingen konsistent mikromiljø ble observert for økte histidinmodifikasjoner, bortsett fra en moderat preferanse for histidiner i løkkeregionen.
PDPL har også blitt brukt til å karakterisere subcellulære proteomer med proteomspesifisitet og dekning som minst kan sammenlignes med andre nærhetsmerking og organellspesifikke kjemiske probemetoder.Nærhetsmarkører har også blitt brukt med hell for å karakterisere overflate-, lysosomale og sekretom-assosierte proteomer46,47.Vi tror at PDPL vil være kompatibel med disse subcellulære organellene.I tillegg utfordret vi PDPL ved å identifisere mål for cytosolisk proteinbinding som er mer komplekse enn membranbundne proteiner på grunn av deres dynamiske egenskaper og involvering i mer tidsmessige interaksjoner.PDPL ble påført to proteiner, den transkripsjonelle koaktivatoren BRD4 og den sykdomsassosierte ligasen E3 Parkin.Disse to proteinene ble valgt ikke bare for deres grunnleggende biologiske funksjoner, men også for deres kliniske relevans og terapeutiske potensial.For disse to interessepunktene ble kjente bindingspartnere så vel som uregistrerte mål identifisert.Spesielt ble det faseseparasjonsassosierte proteinet SFPQ bekreftet av co-IP, noe som kan indikere en ny mekanisme der BRD4 (kort isoform) regulerer LLPS.Samtidig mener vi at identifisering av Parkin-substrater er et scenario der det kreves identifisering av indirekte lim.Vi identifiserte to uidentifiserte parkinsubstrater og bekreftet deres nedbrytning langs ubiquitinering-proteasomveien.Nylig er det utviklet en mekanismebasert fangststrategi for å oppdage hydrolasesubstrater ved å fange dem med enzymer.Selv om dette er en veldig kraftig metode, er den ikke egnet for analyse av substrater involvert i dannelsen av store komplekser og krever dannelse av kovalente bindinger mellom enzymet og substratet.Vi forventer at PDPL kan utvides til å studere andre proteinkomplekser og enzymfamilier, slik som deubiquitinase- og metalloproteasefamiliene.
En ny form for miniSOG, kalt SOPP3, er utviklet med forbedret singlet oksygenproduksjon.Vi sammenlignet miniSOG med SOPP3 og fant forbedret merkeytelse, selv om signal-til-støy-forholdet forble uendret (tilleggsfig. 11).Vi antok at optimalisering av SOPP3 (f.eks. gjennom rettet evolusjon) ville føre til mer effektive fotosensibiliserende proteiner som krever kortere lystider og dermed tillate mer dynamiske cellulære prosesser å bli fanget.Spesielt er den nåværende versjonen av PDPL begrenset til det cellulære miljøet, da det krever blått lys og ikke kan trenge gjennom dype vev.Denne funksjonen utelukker bruken i dyremodellstudier.Kombinasjonen av optogenetikk med PDPL kan imidlertid gi en mulighet for dyreforskning, spesielt i hjernen.I tillegg fjerner andre konstruerte infrarøde fotosensibilisatorer også denne begrensningen.Det pågår for tiden forskning på dette området.
HEK293T-cellelinjen ble oppnådd fra ATCC (CRL-3216).Cellelinjen testet negativt for mykoplasmainfeksjon og ble dyrket i DMEM (Thermo, #C11995500BT) supplert med 10 % føtalt bovint serum (FBS, Vistech, #SE100-B) og 1 % penicillin/streptomycin (Hyclone, #SV30010).vokst inn.
3-aminofenylen (prøve 3) og (4-etynylfenyl)metanamin (prøve 4) ble kjøpt fra Bidepharm.Propylamin (probe 2) ble kjøpt fra Energy-chemicals.N-(2-aminofenyl)pent-4-ynamid (probe 1) ble syntetisert i henhold til publiserte metoder.
Supplerende tabell 1 viser de genetiske konstruksjonene som er brukt i denne studien.MiniSOG- og KillerRed-sekvensene ble klonet fra et gaveplasmid fra P. Zou (Peking University).Den mitokondrielle matrisemålrettingssekvensen ble avledet fra de 23 N-terminale aminosyrene til COX4 og klonet inn i de angitte vektorene ved å bruke en Gibson-sammenstilling (Beyotime, #D7010S).For å målrette membranen og kjernen til det endoplasmatiske retikulumet, SEC61B humant DNA (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) amplifisert ved PCR fra et cDNA-bibliotek av HEK293T-celler, og H2B DNA (donert av D. Lin, Shenzhen Bay Laboratory) og klonet, som nevnt ovenfor.Med mindre annet er angitt, ble andre proteingener brukt for transfeksjon og konstruksjon av stabile cellelinjer PCR-amplifisert fra HEK293T-celle-cDNA-biblioteket.G3S (GGGS) og G4S (GGGGS) ble brukt som linkere mellom agnproteinet og miniSOG.En V5-epitop-tag (GKPIPNPLLGLDST) ble lagt til disse fusjonskonstruksjonene.For ekspresjon i pattedyr og for å etablere en stabil cellelinje, ble miniSOG-fusjonskonstruksjonen subklonet inn i pLX304 lentiviral vektor.For bakteriell ekspresjon ble miniSOG klonet inn i pET21a-vektoren merket 6xHis ved C-terminalen.
HEK293T-celler ble sådd med 2,0 x 105 celler per brønn i seks-brønns plater og transfektert 24 timer senere med rekombinante lentivirale plasmider (2,4 μg pLX304) og virale pakkeplasmider (1,5 μg psPAX2 og 1,2 μg psPAX2 og 1,2 μg med Lip0μgtime med Lip0μgtime) , #C0533), omtrent 80 % fusjon.Etter transfeksjon over natten ble mediet skiftet og inkubert i ytterligere 24 timer.Innsamlingen av viruset ble utført etter 24, 48 og 72 timer.Før infeksjon av målcellelinjene ble det virale mediet filtrert gjennom et 0,8 μm filter (Merck, #millex-GP) og polybrene (Solarbio, #H8761) ble tilsatt til en konsentrasjon på 8 μg/ml.Etter 24 timer fikk cellene komme seg ved å bytte medium.Celler ble valgt ved å bruke 5 μg/ml blasticidin (Solarbio, #3513-03-9) for de tre første passasjene som et lavere stringent utvalg.Brukte deretter 20 μg/ml som et strengere regime for de neste tre passasjene.
Celler ble sådd i 12-brønners kamre (Ibidi, #81201) med en tetthet på omtrent 20 000 celler per brønn.For å forbedre adhesjonen av HEK293T-celler, tilsett 50 µg/ml fibronektin (Corning, #356008) fortynnet i fosfatbufret saltvann (PBS, Sangon, #B640435) ved 37 °C.Kamrene ble forbehandlet i 1 time og deretter fjernet med PBS.Etter 24 timer ble cellene vasket én gang med PBS, inkubert med 1 mM probe 3 i frisk Hanks' balanserte saltløsning (HBSS, Gibco, #14025092) i 1 time ved 37 °C, og deretter inkubert med en blå LED (460 nm) ).) ble bestrålt i 10 minutter ved romtemperatur.Deretter ble cellene vasket to ganger med PBS og fiksert med 4% formaldehyd i PBS (Sangon, #E672002) i 15 minutter ved romtemperatur.Overskudd av formaldehyd ble fjernet fra fikserte celler ved å vaske tre ganger med PBS.Cellene ble deretter permeabilisert med 0,5 % Triton X-100 (Sangon, #A600198) i PBS og vasket 3 ganger med PBS.Fjern deretter kammeret og tilsett til hver prøve 25 µl av en klikkreaksjonsblanding som inneholder 50 µM Cy3-azid (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4) og 0,5 mg/ml natriumaskorbat (Aladdin, nr. S105024) og inkubert i 30 minutter ved romtemperatur.Etter en hurtigreaksjon ble cellene vasket seks ganger med PBS inneholdende 0,05 % Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) og deretter blokkert med 5 % BSA (Abcone, #B24726) i PBST i 30 minutter ved romtemperatur.
For kolokaliseringsimmunfarging ble celler inkubert med primære antistoffer i henhold til de angitte forholdene: mus anti-V5 tag mAb (1:500, CST, #80076), kanin anti-Hsp60 mAb (1:1000), ABclonal, #A0564), kanin polyklonalt anti-calnexin antistoff (1:500, Abcam, #ab22595) eller kanin anti-lamin A/C monoklonalt antistoff (1:500; CST, #2032) ved 4 °C over natten.Etter vask 3 ganger med PBST, ble cellene inkubert med sekundære antistoffer: geit-anti-kanin Alexa Fluor 488 (Thermo, #A11034) fortynnet 1:1000, geit-anti-mus Alexa Fluor 594 (CST, #8889) fortynnet 1:1000.fortynning Fortynn ved romtemperatur i 30 minutter.Cellene ble deretter vasket 3 ganger med PBST og motfarget med DAPI (Thermo, #D1306) i PBS i 10 minutter ved romtemperatur.Etter 3 vaskinger med PBS ble cellene forseglet i 50 % glyserol (Sangon, #A600232) i PBS for avbildning.Immunofluorescerende bilder ble tatt med et ZEISS LSM 900 Airyscan2 konfokalmikroskop og ZNE 3.5-programvare.
For singlet oksygen fluorescerende avbildning, ble cellene vasket to ganger med Hanks HEPES buffer før tilsetning av 100 nM Si-DMA i Hanks HEPES buffer (DOJINDO, #MT05).Etter eksponering for lys ble cellene inkubert i en CO2-inkubator ved 37°C i 45 minutter.Cellene ble deretter vasket to ganger med Hanks' HEPES-buffer og motfarget med Hoechst i Hanks' HEPES-buffer i 10 minutter ved romtemperatur og visualisert ved bruk av et ZEISS LSM 900 konfokalmikroskop., #M36008) i HBSS-buffer som inneholder kalsium og magnesium.Etter eksponering for lys eller doksorubicin (MCE, #HY-15142A), ble cellene inkubert i en CO2-inkubator ved 37°C i 10 minutter, vasket to ganger med HBSS-buffer og inkubert med Hoechst i HBSS-buffer ved romtemperatur.minutter.Doxorubicin ble brukt som en positiv probekontroll hvor cellene ble behandlet med 20 μM doxorubicin i HBSS inneholdende 1% BSA i 30 minutter.Immunofluorescerende bilder ble oppnådd ved bruk av et Zeiss LSM 900 konfokalmikroskop.
HEK293T-celler som stabilt uttrykker mito-miniSOG ble sådd med en tetthet på omtrent 30 % i 15 cm skåler.Etter 48 timer, når ~80 % konfluens ble nådd, ble cellene vasket én gang med PBS, inkubert med 1 mM Probe 3 i fersk HBSS-buffer i 1 time ved 37 °C og deretter opplyst med en blå LED i 10 minutter i rommet temperatur..Deretter ble cellene vasket to ganger med PBS, skrapet og resuspendert i iskald PBS-buffer inneholdende EDTA-frie proteasehemmere (MCE, #HY-K0011).Celler ble lysert ved å sonikere spissen i 1 minutt (1 sekund på og 1 sekund av ved 35 % amplitude).Den resulterende blandingen ble sentrifugert ved 15.871 xg i 10 minutter ved 4°C for å fjerne rusk, og supernatantkonsentrasjonen ble justert til 4 mg/ml ved bruk av et BCA-proteinanalysesett (Beyotime, #P0009).Kombiner 1 ml av lysatet ovenfor med 0,1 mM fotonedbrytbart biotinazid (Confluore, #BBBD-14), 1 mM TCEP (Sangon, #A600974), 0,1 mM TBTA-ligand (Aladdin, #T162437) og 1 mM CuSO4-inkubator med bunninkubator roter opp i 1 time ved romtemperatur.Etter en rask reaksjon, tilsett blandingen til den forhåndsblandede løsningen (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml:1 ml:3 ml) i et 10 ml hetteglass.Prøvene ble blandet og sentrifugert ved 4500 g i 10 minutter ved romtemperatur.De nedre og øvre løsningene ble kastet, bunnfallet ble vasket to ganger med 1 ml metanol og sentrifugert ved 15871 xg i 5 minutter ved 4°C.Tilsett 1 ml 8 M urea (Aladdin, nr. U111902) i 25 mM ammoniumbikarbonat (ABC, Aladdin, nr. A110539) for å løse opp bunnfallet.Prøver ble rekonstituert med 10 mM ditiotreitol (Sangon, #A100281 i 25 mM ABC) i 40 minutter ved 55°C etterfulgt av tilsetning av 15 mM frisk jodacetamid (Sangon, #A600539) ved romtemperatur i mørket.Alkylering innen 30 minutter..Ytterligere 5 mM ditiotreitol ble tilsatt for å stoppe reaksjonen.Forbered omtrent 100 µl NeutrAvidin agarosekuler (Thermo, #29202) for hver prøve ved å vaske 3 ganger med 1 ml PBS.Ovennevnte proteomløsning ble fortynnet med 5 ml PBS og inkubert med forhåndsvaskede NeutrAvidin agarosekuler i 4 timer ved romtemperatur.Kulene ble deretter vasket 3 ganger med 5 ml PBS inneholdende 0,2% SDS (Sangon, #A600485), 3 ganger med 5 ml PBS inneholdende 1 M urea, og 3 ganger med 5 ml ddH2O.Kulene ble deretter høstet ved sentrifugering og resuspendert i 200 μl 25 mM ABC inneholdende 1 M urea, 1 mM CaCl 2 (Macklin, #C805228) og 20 ng/μl trypsin (Promega, #V5280).Trypsiniseres over natten ved 37 °C med rotasjon.Reaksjonen ble stoppet ved å tilsette maursyre (Thermo, # A117-50) inntil pH nådde 2-3.Kulene ble vasket 3 ganger med 1 ml PBS inneholdende 0,2% SDS, 3 ganger med 1 ml PBS inneholdende 1 M urea, og deretter 3 ganger med 1 ml destillert vann.De modifiserte peptidene ble frigjort ved lett lysis (365 nm) i 90 minutter ved bruk av 200 μl 70 % MeOH.Etter sentrifugering ble supernatanten samlet.Kulene ble deretter vasket én gang med 100 μl 70 % MeOH og supernatantene ble samlet.Prøver ble tørket i en Speedvac vakuumkonsentrator og lagret ved -20°C inntil analyse.
For å identifisere og kvantifisere singlett oksygenmodifiserte peptider, ble prøver oppløst i 0,1% maursyre og 1 μg peptider ble analysert ved hjelp av et Orbitrap Fusion Lumos Tribrid massespektrometer utstyrt med en nano ESI-kilde fra Tune og Xcalibur fra leverandørprogramvare 4.3.Prøver ble separert på en 75 µm × 15 cm internt pakket kapillærkolonne med 3 µm C18-materiale (ReproSil-pur, #r13.b9.) og koblet til et EASY-nLC 1200 UHPLC-system (Thermo).Peptidene ble separert ved lineær 95 minutters gradientkromatografi fra 8 % løsningsmiddel B til 50 % løsningsmiddel B (A = 0,1 % maursyre i vann, B = 0,1 % maursyre i 80 % acetonitril), deretter lineært økt til 98 % B min. på 6 min ved en strømningshastighet på 300 nl/min.Orbitrap Fusion Lumos samler inn data vekselvis mellom full MS-skanning og MS2-skanning avhengig av dataene.Sputteringsspenningen ble satt til 2,1 kV og temperaturen til ionetransportkapillæren var 320°C.MS-spektra (350-2000 m/z) ble samlet med en oppløsning på 120 000, AGC 4 × 105 og en maksimal inngangstid på 150 ms.De 10 vanligste flerladede forløperne i hver full skanning ble fragmentert ved bruk av HCD med en normalisert kollisjonsenergi på 30 %, et firpolet isolasjonsvindu på 1,6 m/z og en oppløsningsinnstilling på 30 000.Et AGC-mål for tandem-massespektrometri ved bruk av 5×104 og maksimal inngangstid 150 ms.Det dynamiske unntaket er satt til 30 sekunder. Ikke-tilordnede ioner eller de med en ladning på 1+ og >7+ ble avvist for MS/MS. Ikke-tilordnede ioner eller de med en ladning på 1+ og >7+ ble avvist for MS/MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Ikke-tilordnede ioner eller ioner med en ladning på 1+ og >7+ ble avvist for MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS. Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Uspesifiserte ioner eller ioner med ladninger på 1+ og >7+ ble avvist for MS/MS.
Rådataene behandles ved hjelp av FragPipe-databehandlingsplattformen basert på MSFragger.Masseskjevheter og tilsvarende aminosyrer ble bestemt ved bruk av en åpen søkealgoritme med en forløpermassetoleranse på -150 til 500 Da.Modifiserte peptider ble deretter identifisert ved bruk av histidinmodifikasjoner med masseøkninger på +229,0964 og +247,1069 Da i PD (Proteome Discoverer 2.5, Thermo).
Celler som stabilt uttrykker det sammenslåtte miniSOG-genet ble belagt i 6 cm skåler.Etter å ha nådd ~80% konfluens, ble cellene vasket én gang med HBSS (Gibco, #14025092), deretter inkubert med kjemiske prober i HBSS i 1 time ved 37°C og belyst med blått lys.10W LED i 20 minutter ved romtemperatur.For å bestemme hvilken type reaktive oksygenarter som er involvert i PDPL, 0,5 mM vitamin C (MCE, #HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0), 100 mM mannitol (Energy Chemical, #69-65-8), 100 μM H2O2, 10 mM NaN3 ble tilsatt til cellene som kosttilskudd.Etter vask med kald PBS ble cellene skrapet, samlet i 1,5 ml sentrifugerør og sonikert med en spiss i 1 min i 200 μl PBS med 1x proteasehemmer uten EDTA (1 s og 1 s uten, amplitude 35%).Den resulterende blandingen ble sentrifugert ved 15 871 x g i 10 minutter ved 4 °C og supernatantkonsentrasjonen ble justert til 1 mg/ml ved bruk av et BCA-proteinanalysesett.Omtrent 50 ul av lysatet ovenfor ble inkubert med 0,1 mM rhodaminazid (Aladdin, nr. T131368), 1 mM TCEP, 0,1 mM TBTA-ligand og 1 mM CuSO4 i 1 time ved romtemperatur med rotasjon fra bunn til topp.Etter klikkreaksjonen ble utfelling med aceton utført ved å tilsette 250 μl forhåndskjølt aceton til prøvene, inkubere ved -20°C i 20 minutter og sentrifugere ved 6010×g i 10 minutter ved 4°C.Samle pelleten og kok i 50 µl 1x Laemmlis buffer i 10 minutter ved 95 °C.Prøver ble deretter analysert på SDS-PAGE lange geler og visualisert ved bruk av Bio-rad ChemiDoc MP Touch-bildesystem med Image Lab Touch-programvare.
Ekspresjon og rensing av det rekombinante miniSOG-6xHis-proteinet ble utført som tidligere beskrevet.Kort fortalt ble E. coli BL21(DE3)-celler (TransGen, #CD701-02) transformert med pET21a-miniSOG-6xHis og proteinekspresjon ble indusert med 0,5 mM IPTG (Sangon, #A600168).Etter cellelyse ble proteiner renset ved bruk av Ni-NTA agarosekuler (MCE, nr. 70666), dialysert mot PBS og lagret ved –80°C.
For en antistoffbasert in vitro-merkingsnærhetsanalyse, bland 100 μM renset miniSOG, 1 mM probe 3 og 1 μg monoklonalt antistoff fra mus (TransGen, #HT501-01) i PBS til et totalt reaksjonsvolum på 50 μl..Reaksjonsblandingen ble bestrålt med blått LED-lys i 0, 2, 5, 10 og 20 minutter ved romtemperatur.Blandingen ble inkubert med 0,1 mM biotin-PEG3-azid (Aladdin, #B122225), 1 mM TCEP, 0,1 mM TBTA-ligand og 1 mM CuSO4 i 1 time ved romtemperatur på en oppadgående rister.Etter en rask reaksjon, tilsett 4x Laemmlis buffer direkte til blandingen og kok ved 95°C i 10 min.Prøver ble analysert på SDS-PAGE geler og analysert ved western blotting med streptavidin-HRP (1:1000, Solarbio, #SE068).
Et histidinholdig syntetisk peptid med C-terminal amidering (LHDALDAK-CONH2) ble brukt til å analysere nærliggende peptidbasert in vitro-merking.I denne analysen ble 100 μM renset miniSOG, 10 mM probe 3 og 2 μg/ml syntetisk peptid blandet i PBS i et totalt reaksjonsvolum på 50 μl.Reaksjonsblandingen ble bestrålt med blått LED-lys i 1 time ved romtemperatur.En mikroliter prøve ble analysert ved bruk av et LC-MS-system (Waters, SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight massespektrometer med MassLynx spektrumanalyseprogramvare).
HEK293T-celler som stabilt uttrykker miniSOG-fusjonsgenet ble sådd i 10 cm skåler for linjer med forskjellig organelllokalisering (Mito, ER, Nucleus) og 15 cm skåler for Parkin-miniSOG- og BRD4-miniSOG-linjer.Etter å ha nådd ~90% konfluens, ble cellene vasket én gang med HBSS, deretter inkubert med probe 3 i HBSS i 1 time ved 37 °C og belyst med en 10 W blå LED ved romtemperatur.For ikke-kontakt merking av Parkin ble 10 µM protonkarbonylcyanidbærer m-klorfenylhydrazon CCCP (Solarbio, #C6700) med probe 3 i HBSS tilsatt i 1 time ved 37°C.Cellelyse-, klikkkjemi-, reduksjons- og alkyleringstrinnene var de samme som beskrevet ovenfor, bortsett fra at 2 mg lysat ble tilsatt og biotin PEG3-azid ble brukt i klikkreaksjonen i stedet for fotonedbrytbart biotinazid.Etter anrikning ble kulene vasket 3 ganger med 5 ml PBS inneholdende 0,2% SDS, 3 ganger med 5 ml PBS inneholdende 1 M urea, og 3 ganger med 5 ml PBS.Deretter ble 2 ug trypsin tilsatt til 300 ul 25 mM ABC inneholdende 1 M urea for å spalte proteinet over natten ved 37°C.Reaksjonen ble stoppet ved å tilsette maursyre inntil en pH på 2-3 ble nådd.Etter trypsinisering på perler ble peptidløsningen avsaltet ved bruk av en SOLAµ HRP-kolonne (Thermo, #60209-001) og tørket i en Speedvac vakuumkonsentrator.Peptidene ble gjenoppløst i 0,1 % maursyre og 500 ng peptider ble analysert ved å bruke et Orbitrap Fusion Lumos Tribrid massespektrometer utstyrt med nano-ESI-kilden beskrevet ovenfor.Peptidene ble separert på kommersielle RP-HPLC-prekolonner (75 μm x 2 cm) (Thermo, nr. 164946) og analytiske RP-HPLC-kolonner (75 μm x 25 cm) (Thermo, nr. 164941), begge fylt med 2 μm.gradient fra 8 % til 35 % ACN på 60 minutter, deretter lineært økt til 98 % B på 6 minutter ved en strømningshastighet på 300 Nl/min.MS-spektra (350-1500 m/z) ble samlet med en oppløsning på 60 000, AGC 4 × 105 og en maksimal inngangstid på 50 ms.Utvalgte ioner ble sekvensielt fragmentert av HCD i 3 s sykluser med en normalisert kollisjonsenergi på 30 %, et quadrupol isolasjonsvindu på 1,6 m/z og en oppløsning på 15000. Et 5 × 104 tandem massespektrometer AGC mål og en maksimal injeksjonstid på 22 ms ble brukt.Den dynamiske ekskluderingen er satt til 45 sekunder. Ikke-tilordnede ioner eller de med en ladning på 1+ og >7+ ble avvist for MS/MS. Ikke-tilordnede ioner eller de med en ladning på 1+ og >7+ ble avvist for MS/MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Ikke-tilordnede ioner eller ioner med en ladning på 1+ og >7+ ble avvist for MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS. Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Uspesifiserte ioner eller ioner med ladninger på 1+ og >7+ ble avvist for MS/MS.
Prøveforberedelsestrinnene frem til anrikningen av NeutrAvidin-kulene var de samme som i LC-MS/MS-analysen beskrevet ovenfor.Omtrent 50 μg lysat ble brukt som input for lastekontroll og 2 mg lysat ble brukt til klikkreaksjoner.Etter anrikning og vasking med neutravidin ble de bundne proteinene eluert ved å tilsette 50 μl av Laemmlis buffer til agaroseharpikskulene og koke ved 95°C i 5 minutter.Kontrollbelastningstilførsel og perleanrikede prøver ble analysert ved SDS-PAGE og overført til PVDF-membraner (Millipore, #ISEQ00010) ved standard Western blot-metoder.Membranene ble blokkert med 5 % skummet melk (Sangon, #A600669) i TBS inneholdende 0,1 % tween-20 (TBST) og inkubert sekvensielt med primære og sekundære antistoffer.Primære antistoffer ble fortynnet 1:1000 i 5 % skummet melk i TBST og inkubert over natten ved 4°C.Sekundære antistoffer ble brukt i et forhold på 1:5000 og inkubert i 1 time ved romtemperatur.Membranene ble visualisert ved kjemiluminescens ved bruk av Chemidoc MP-bildesystemet.Alle ukuttede skanninger av blotter og geler i figuren presenteres som rådata.
Primære antistoffer brukt i denne studien inkluderte kanin anti-SFPQ monoklonalt antistoff (CST, nr. 71992), kanin anti-FUS monoklonalt antistoff (CST, nr. 67840), kanin anti-NSUN2 polyklonalt antistoff (Proteintech, nr. 20854-1) AP), kanin anti-mSin3A polyklonalt antistoff (Abcam, #ab3479), mus anti-tag monoklonalt antistoff (TransGen, #HT201-02), mus anti-β-aktin monoklonalt antistoff (TransGen, #HC201-01), kanin anti -CDK2 monoklonalt antistoff (ABclonal, #A0094), kanin monoklonalt antistoff mot CTBP1 (ABclonal, #A11600), kanin polyklonalt antistoff mot DUT (ABclonal, #A2901), kanin polyklonalt antistoff mot PS5, #ABrclonal-antistoff, #A250nal- DNAJB1 polyklonalt antistoff (ABclonal, # A5504).Disse antistoffene ble brukt i en 1:1000 fortynning i 5 % skummet melk i TBST.De sekundære antistoffene som ble brukt i denne studien inkluderte anti-kanin IgG (TransGen, #HS101-01), anti-muse IgG (TransGen, #HS201-01) i en 1:5000 fortynning.
For ytterligere å undersøke om BRD4 interagerer med SFPQ, ble stabile HEK293T- og BRD4-miniSOG-celler som overuttrykker HEK293T belagt i 10 cm skåler.Celler ble vasket med kald PBS og lysert i 1 ml Pierce IP lyseringsbuffer (Thermo Fisher, #87787) med EDTA-fri proteaseinhibitor i 30 minutter ved 4°C.Deretter ble lysatene samlet i 1,5 ml sentrifugerør og sentrifugert ved 15 871 xg i 10 minutter ved 4°C.Supernatanten ble høstet og inkubert med 5 ug anti-V5-merket musemonoklonalt antistoff (CST, #80076) over natten ved 4°C.Vask ca. 50 µl protein A/G magnetiske perler (MCE, #HY-K0202) to ganger med PBS som inneholder 0,5 % Tween-20.Deretter ble cellelysatene inkubert med magnetiske kuler i 4 timer ved 4°C med rotasjon fra bunn til topp.Deretter ble kulene vasket fire ganger med 1 ml PBST-buffer og kokt ved 95°C i 5 minutter.Prøver ble analysert på SDS-PAGE-geler og overført til PVDF-membraner ved bruk av standard Western blot-metoder.Membranene ble blokkert i 5 % skummet melk i TBST og inkubert sekvensielt med primære og sekundære antistoffer.Primært antistoff Kanin anti-SFPQ monoklonalt antistoff (CST, #71992) ble brukt i et forhold på 1:1000 i 5 % skummet melk i TBST og inkubert over natten ved 4°C.Anti-kanin IgG ble brukt i et forhold på 1:5000 og inkubert i 1 time ved romtemperatur.Membranene ble visualisert ved kjemiluminescens ved bruk av Chemidoc MP-bildesystemet.
Alle strukturer som ble brukt for SASA-analysen (Solvent Accessible Surface Area) ble hentet fra Protein Data Bank (PDB)52 eller AlphaFold Protein Structure Database53.Absolutt SASA ble beregnet for hver rest ved bruk av FreeSASA-programmet.Bare fullstendige og entydige SASA-data for merket histidin og dets naboer ble brukt for å oppnå gjennomsnittlig SASA for hver struktur.Den relative løsningsmiddeltilgjengelighet (RSA) for hvert histidin ble beregnet ved å dele den absolutte SASA-verdien med det empiriske maksimalt mulige restoverflatearealet tilgjengelig for løsningsmidlet.Alle histidiner ble deretter klassifisert som skjulte hvis gjennomsnittlig RSA var under 20 %, ellers eksponert56.
Råfiler oppnådd i DDA-modus ble søkt ved hjelp av Proteome Discoverer (v2.5) eller MSfragger (Fragpipe v15.0) i den aktuelle SwissProt-verifiserte proteindatabasen som inneholder vanlige forurensninger.Peptidene krevde komplett trypsin med to manglende spaltningssteder, karbamoylmetylering som en fast modifikasjon og metioninoksidasjon som en dynamisk modifikasjon.Forløper- og fragmentvekttoleranser ble satt til henholdsvis 10 ppm og 0,02 Da (MS2 Orbitrap). Forurensningstreff ble fjernet, og proteiner ble filtrert for å oppnå en falsk oppdagelsesrate på <1 %. Forurensningstreff ble fjernet, og proteiner ble filtrert for å oppnå en falsk oppdagelsesrate på <1 %. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы, чтобы получить коэфициенте <1%. Forurensningstreff ble fjernet og proteiner filtrert for å gi en falsk deteksjonsrate på <1 %.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1 %的错误发现率. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы for достижения уровня ложных <1%. Forurensningstreff ble fjernet og proteiner filtrert for å oppnå en falsk positiv rate på <1 %.For kvantitativ analyse uten bruk av etiketter ble normalisert proteininnhold fra tre biologiske repetisjoner brukt.Protein subcellulær lokaliseringsanalyse ble utført ved bruk av Gene Ontology (GO) analyse fra DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 og databaser kompilert og publisert av Alice Ting-gruppen.Vulkankartet ble hentet fra Perseus (v1.6.15.0). Endringer i proteinoverflod ble testet for statistisk signifikans ved å bruke en tosidig t-test, og proteintreff ble identifisert med overflodsendring >2 (med mindre annet er angitt) og p-verdi <0,05. Endringer i proteinoverflod ble testet for statistisk signifikans ved å bruke en tosidig t-test, og proteintreff ble identifisert med overflodsendring >2 (med mindre annet er angitt) og p-verdi <0,05. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. Endringer i proteininnhold ble testet for statistisk signifikans ved å bruke en to-halet t-test, og proteintreff ble identifisert med innholdsendring >2 (med mindre annet er angitt) og ap-verdi <0,05.使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 丰度 倍数 变化 的 统计 显着性 ， 并 蛋白质 命 中 的 的 丰度 变化> 2 （另 有 说明） 和 P 值 <0,05。使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 倍 数 变化 的 统计 显着性 并 蛋白质 命 中 的 丰度 丰度 变化> 2 （有 说明） 和 P 值 <0,05。 Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. Statistisk signifikans av fold endringer i proteininnhold ble testet ved hjelp av en to-halet t-test, og proteinmatch ble bestemt for innholdsendringer >2 (med mindre annet er angitt) og p-verdier <0,05.Proteininteraksjonsanalyse ble utført ved bruk av GO-analyse sammen med String-databasen.
Tre biologiske replikater ble utført med lignende resultater.Statistisk analyse ble gjort med GraphPad Prism (GraphPad-programvare) og vulkanplott ble generert med Perseus (v1.6.15.0).For å sammenligne de to gruppene ble p-verdier bestemt ved å bruke en to-halet Students t-test.Kun singletonproteiner identifisert minst to ganger i forsøksgruppen ble inkludert i vulkanplottene, og de tilsvarende manglende verdiene i kontrollgruppen ble erstattet med Perseus fra en normalfordeling slik at p-verdien kunne beregnes.Feilstolper representerer gjennomsnitt ± standardavvik.I proteomiske analyser for statistisk analyse ble overfloden av proteiner som dukket opp i minst to biologiske replikater beholdt.Statistiske metoder ble ikke brukt for å forhåndsbestemme utvalgsstørrelsen.Eksperimentene er ikke tilfeldige.Forskerne var ikke blinde for oppgavene under forsøket og evalueringen av resultatene.
For mer informasjon om studiedesign, se naturforskningsrapporten som er knyttet til denne artikkelen.
Massespektrometridataene innhentet i denne studien ble sendt til ProteomeXchange Consortium via iProX57-partnerlageret under datasett-ID PXD034811 (PDPL-MS-datasett).Rådata leveres i form av rådatafiler.Denne artikkelen inneholder de originale dataene.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Bli kjent med nabolaget: bruk av nærhetsavhengig biotinylering for å karakterisere proteinkomplekser og kartlegge organeller. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Bli kjent med nabolaget: bruk av nærhetsavhengig biotinylering for å karakterisere proteinkomplekser og kartlegge organeller.Gingras, AS, Abe, KT og Raut, B. Kjennskap til omgivelser: bruk av nærhetsavhengig biotinylering for å karakterisere proteinkomplekser og kartlegge organeller. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Forstå nabolaget: bruk nabolagets avhengighet av biologisk liv.Gingras, AS, Abe, KT og Raut, B. Forståelse av nærhet: karakterisering av proteinkomplekser og kartlegging av organeller ved bruk av nærhetsavhengig biotinylering.Strøm.Min mening.Kjemisk.biologi 48, 44–54 (2019).
Geri, JB et al.Kartlegging av mikromiljøet ved å overføre Dexter-energi til immunceller.Science 367, 1091–1097 (2020).
Hertling, EL et al.To-proteomskalanettverk oppdager cellespesifikk ombygging av det menneskelige interaktomet.Cells 184, 3022–3040.e3028 (2021).
Innleggstid: 15. september 2022
