Nyheter

Takk for at du besøker Nature.com.Nettleserversjonen du bruker har begrenset CSS-støtte.For den beste opplevelsen anbefaler vi at du bruker en oppdatert nettleser (eller deaktiverer kompatibilitetsmodus i Internet Explorer).I mellomtiden, for å sikre fortsatt støtte, vil vi gjengi nettstedet uten stiler og JavaScript.
Effektive fotosensibilisatorer er spesielt viktige for den utbredte kliniske bruken av fototerapi.Imidlertid lider konvensjonelle fotosensibilisatorer generelt av kortbølgelengdeabsorpsjon, utilstrekkelig fotostabilitet, lavt kvanteutbytte av reaktive oksygenarter (ROS) og aggregeringsindusert slukking av ROS.Her rapporterer vi en nær-infrarød (NIR) supramolekylær fotosensibilisator (RuDA) mediert av selvmontering av Ru(II)-aren organometalliske komplekser i vandig løsning.RuDA kan bare generere singlett oksygen (1O2) i aggregert tilstand, og den viser åpenbar aggregeringsindusert 1O2 generasjonsadferd på grunn av en betydelig økning i crossover prosessen mellom singlett-triplett systemet.Under påvirkning av 808 nm laserlys viser RuDA et 1O2 kvanteutbytte på 16,4 % (FDA-godkjent indocyaningrønn: ΦΔ=0,2%) og en høy fototermisk konverteringseffektivitet på 24,2 % (kommersielle gullnanorods) med utmerket fotostabilitet.: 21,0 %, gull nanoskall: 13,0 %).I tillegg kan RuDA-NP-er med god biokompatibilitet fortrinnsvis akkumulere på tumorsteder, noe som forårsaker betydelig tumorregresjon under fotodynamisk terapi med en 95,2% reduksjon i tumorvolum in vivo.Denne aggregeringsforbedrende fotodynamiske terapien gir en strategi for å utvikle fotosensibilisatorer med gunstige fotofysiske og fotokjemiske egenskaper.
Sammenlignet med konvensjonell terapi er fotodynamisk terapi (PDT) en attraktiv behandling for kreft på grunn av dens betydelige fordeler som nøyaktig spatiotemporal kontroll, ikke-invasivitet, ubetydelig medikamentresistens og minimering av bivirkninger 1,2,3.Under lysbestråling kan fotosensibilisatorene som brukes aktiveres for å danne svært reaktive oksygenarter (ROS), som fører til apoptose/nekrose eller immunrespons4,5. Imidlertid har de fleste konvensjonelle fotosensibilisatorer, som kloriner, porfyriner og antrakinoner, relativt kort bølgelengdeabsorpsjon (frekvens < 680 nm), noe som resulterer i dårlig lyspenetrasjon på grunn av den intense absorpsjonen av biologiske molekyler (f.eks. hemoglobin og melanin) i den synlige regionen6,7. Imidlertid har de fleste konvensjonelle fotosensibilisatorer, som kloriner, porfyriner og antrakinoner, relativt kort bølgelengdeabsorpsjon (frekvens < 680 nm), noe som resulterer i dårlig lyspenetrasjon på grunn av den intense absorpsjonen av biologiske molekyler (f.eks. hemoglobin og melanin) i den synlige regionen6,7. Однако большинство обычных фотосенсибилизаторов, таких как хлорины, порфирины и антрахиноны, обладают относительно коротковолновым поглощением (частота < 680 нм), что приводит к плохому проникновению света из-за интенсивного поглощения биологических молекул (например, гемоглобина и меланина) в видимая область6,7. De fleste vanlige fotosensibilisatorer som klorer, porfyriner og antrakinoner har imidlertid relativt kort bølgelengdeabsorpsjon (< 680 nm), noe som resulterer i dårlig lyspenetrering på grunn av intens absorpsjon av biologiske molekyler (f.eks. hemoglobin og melanin) i det synlige området6,7.°导致光穿透性差.°吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 HI导致光穿透性差. Однако большинство традиционных фотосенсибилизаторов, таких как хлорины, порфирины и антрахиноны, имеют относительно коротковолновое поглощение (частота < 680 нм) из-за сильного поглощения биомолекул, таких как гемоглобин и меланин, что приводит к плохому проникновению света. Imidlertid har de fleste tradisjonelle fotosensibilisatorer som klorer, porfyriner og antrakinoner relativt kort bølgelengdeabsorpsjon (frekvens < 680 nm) på grunn av sterk absorpsjon av biomolekyler som hemoglobin og melanin som resulterer i dårlig lyspenetrasjon.Synlig område 6.7.Derfor er nær-infrarøde (NIR) absorberende fotosensibilisatorer som aktiveres i det 700–900 nm "terapeutiske vinduet" godt egnet for fototerapi.Siden nær infrarødt lys er minst absorbert av biologisk vev, kan det føre til dypere penetrasjon og mindre fotoskader8,9.
Dessverre har eksisterende NIR-absorberende fotosensibilisatorer generelt dårlig fotostabilitet, lav singlet oksygen (1O2) genereringskapasitet og aggregeringsindusert 1O2 quenching, noe som begrenser deres kliniske anvendelse10,11.Selv om det er gjort store anstrengelser for å forbedre de fotofysiske og fotokjemiske egenskapene til konvensjonelle fotosensibilisatorer, har så langt flere rapporter rapportert at NIR-absorberende fotosensibilisatorer kan løse alle disse problemene.I tillegg har flere fotosensibilisatorer vist lovende for effektiv generering av 1O212,13,14 når de bestråles med lys over 800 nm, siden fotonenergien avtar raskt i nær-IR-området.Trifenylamin (TFA) som en elektrondonor og [1,2,5]tiadiazol-[3,4-i]dipyrido[a,c]fenazin (TDP) som en elektronakseptorgruppe Donor-akseptor (DA) type fargestoffer en klasse av fargestoffer, som absorberer nær-infrarødt, som har blitt grundig studert for nær-infrarød bioimaging II og fototermisk terapi (PTT) på grunn av deres smale båndgap.Dermed kan DA-type fargestoffer brukes for PDT med nær-IR-eksitasjon, selv om de sjelden har blitt studert som fotosensibilisatorer for PDT.
Det er velkjent at den høye effektiviteten av intersystem-kryssing (ISC) av fotosensibilisatorer fremmer dannelsen av 1O2.En vanlig strategi for å fremme ISC-prosessen er å forbedre spin-orbit coupling (SOC) av fotosensibilisatorer ved å introdusere tunge atomer eller spesielle organiske deler.Denne tilnærmingen har imidlertid fortsatt noen ulemper og begrensninger19,20.Nylig har supramolekylær selvmontering gitt en nedenfra og opp intelligent tilnærming for fremstilling av funksjonelle materialer på molekylært nivå,21,22 med mange fordeler innen fototerapi: (1) selvmonterte fotosensibilisatorer kan ha potensial til å danne båndstrukturer.Ligner på elektroniske strukturer med en tettere fordeling av energinivåer på grunn av overlappende baner mellom byggesteinene.Derfor vil energitilpasningen mellom den nedre singlett-eksiterte tilstanden (S1) og den nærliggende triplett-eksiterte tilstanden (Tn) bli forbedret, noe som er fordelaktig for ISC-prosessen 23, 24.(2) Supramolekylær montering vil redusere ikke-strålende avslapning basert på den intramolekylære bevegelsesbegrensningsmekanismen (RIM), som også fremmer ISC-prosessen 25, 26.(3) Den supramolekylære sammenstillingen kan beskytte de indre molekylene i monomeren mot oksidasjon og nedbrytning, og forbedrer dermed fotostabiliteten til fotosensibilisatoren.Gitt de ovennevnte fordelene, tror vi at supramolekylære fotosensibilisatorsystemer kan være et lovende alternativ for å overvinne manglene ved PDT.
Ru(II)-baserte komplekser er en lovende medisinsk plattform for potensielle anvendelser i diagnostisering og terapi av sykdommer på grunn av deres unike og attraktive biologiske egenskaper28,29,30,31,32,33,34.I tillegg gir overfloden av eksiterte tilstander og de avstembare fotofysisk-kjemiske egenskapene til Ru(II)-baserte komplekser store fordeler for utviklingen av Ru(II)-baserte fotosensibilisatorer35,36,37,38,39,40.Et bemerkelsesverdig eksempel er ruthenium(II) polypyridylkomplekset TLD-1433, som for tiden er i fase II kliniske studier som en fotosensibilisator for behandling av ikke-muskelinvasiv blærekreft (NMIBC)41.I tillegg er rutenium(II)aren organometalliske komplekser mye brukt som kjemoterapeutiske midler for kreftbehandling på grunn av deres lave toksisitet og enkle modifikasjoner42,43,44,45.De ioniske egenskapene til Ru(II)-aren organometalliske komplekser kan ikke bare forbedre den dårlige løseligheten til DA-kromoforer i vanlige løsningsmidler, men også forbedre sammenstillingen av DA-kromoforer.I tillegg kan den pseudooktaedriske halvsandwichstrukturen til de organometalliske kompleksene av Ru(II)-arener sterisk forhindre H-aggregering av kromoforer av DA-type, og derved lette dannelsen av J-aggregering med rødforskyvede absorpsjonsbånd.Imidlertid kan iboende ulemper med Ru(II)-aren-komplekser, slik som lav stabilitet og/eller dårlig biotilgjengelighet, påvirke den terapeutiske effekten og in vivo-aktiviteten til aren-Ru(II)-komplekser.Imidlertid har studier vist at disse ulempene kan overvinnes ved å innkapsle rutheniumkomplekser med biokompatible polymerer ved fysisk innkapsling eller kovalent konjugering.
I dette arbeidet rapporterer vi DA-konjugerte komplekser av Ru(II)-aren (RuDA) med en NIR-trigger via en koordinasjonsbinding mellom DAD-kromoforen og Ru(II)-aren-delen.De resulterende kompleksene kan selv settes sammen til metallosupramolekylære vesikler i vann på grunn av ikke-kovalente interaksjoner.Spesielt ga den supramolekylære sammenstillingen RuDA med polymerisasjonsinduserte intersystem-overkrysningsegenskaper, noe som betydelig økte ISC-effektiviteten, noe som var veldig gunstig for PDT (fig. 1A).For å øke tumorakkumulering og in vivo biokompatibilitet, ble FDA-godkjent Pluronic F127 (PEO-PPO-PEO) brukt til å innkapsle RuDA47,48,49 for å lage RuDA-NP nanopartikler (Figur 1B) som fungerte som en svært effektiv PDT/dobbel- modus PTT proxy.I kreftfototerapi (figur 1C) ble RuDA-NP brukt til å behandle nakne mus med MDA-MB-231-svulster for å studere effekten av PDT og PTT in vivo.
Skjematisk illustrasjon av den fotofysiske mekanismen til RuDA i monomere og aggregerte former for kreftfototerapi, syntese av B RuDA-NPs og C RuDA-NPs for NIR-aktivert PDT og PTT.
RuDA, bestående av TPA- og TDP-funksjonalitet, ble fremstilt i henhold til prosedyren vist i tilleggsfigur 1 (figur 2A), og RuDA ble karakterisert ved 1H og 13C NMR-spektra, elektrosprayioniseringsmassespektrometri og elementanalyse (tilleggsfigurer 2-4) ).RuDA-elektrontetthetsforskjellskartet for den laveste singlet-overgangen ble beregnet av tidsavhengig tetthetsfunksjonsteori (TD-DFT) for å studere ladningsoverføringsprosessen.Som vist i tilleggsfigur 5, driver elektrontettheten hovedsakelig fra trifenylamin til TDP-akseptorenheten etter fotoeksitasjon, noe som kan tilskrives en typisk overgang til intramolekylær ladningsoverføring (CT).
Kjemisk struktur av malm B Absorpsjonsspektra av malm i blandinger av forskjellige forhold mellom DMF og vann.C Normaliserte absorpsjonsverdier av RuDA (800 nm) og ICG (779 nm) versus tid ved 0,5 W cm-2 av 808 nm laserlys.D Fotonedbrytningen av ABDA indikeres ved RuDA-indusert dannelse av 1O2 i DMF/H2O-blandinger med forskjellig vanninnhold under påvirkning av laserstråling med en bølgelengde på 808 nm og en effekt på 0,5 W/cm2.
Abstrakt - UV-synlig absorpsjonsspektroskopi ble brukt for å studere selvmonteringsegenskapene til malm i blandinger av DMF og vann i forskjellige forhold.Som vist i fig.2B viser RuDA absorpsjonsbånd fra 600 til 900 nm i DMF med et maksimalt absorpsjonsbånd ved 729 nm.Økning av vannmengden førte til en gradvis rødforskyvning av malmabsorpsjonsmaksimum til 800 nm, noe som indikerer J-aggregering av malm i det sammensatte systemet.Fotoluminescensspektrene til RuDA i forskjellige løsningsmidler er vist i tilleggsfigur 6. RuDA ser ut til å vise typisk NIR-II-luminescens med en maksimal emisjonsbølgelengde på ca.1050 nm i henholdsvis CH2Cl2 og CH3OH.Det store Stokes-skiftet (ca. 300 nm) av RuDA indikerer en betydelig endring i geometrien til den eksiterte tilstanden og dannelsen av lavenergi-eksiterte tilstander.Luminescenskvanteutbyttet av malm i CH2Cl2 og CH3OH ble bestemt til å være henholdsvis 3,3 og 0,6%.I en blanding av metanol og vann (5/95, v/v) ble det imidlertid observert en liten rødforskyvning av utslippet og en reduksjon i kvanteutbyttet (0,22%), noe som kan skyldes selvmontering av Ore .
For å visualisere selvmonteringen av ORE, brukte vi flytende atomkraftmikroskopi (AFM) for å visualisere de morfologiske endringene i ORE i metanolløsning etter tilsetning av vann.Når vanninnholdet var under 80 %, ble det ikke observert noen tydelig aggregering (Supplerende Fig. 7).Men med en ytterligere økning i vanninnholdet til 90–95 %, dukket det opp små nanopartikler, noe som indikerte selvmontering av malm.I tillegg påvirket ikke laserbestråling med en bølgelengde på 808 nm absorpsjonsintensiteten til RuDA i vandig løsning (fig. 2C og tilleggsfig. 8).Derimot falt absorbansen av indocyaningrønt (ICG som kontroll) raskt ved 779 nm, noe som indikerer utmerket fotostabilitet av RuDA.I tillegg ble stabiliteten til RuDA-NP i PBS (pH = 5,4, 7,4 og 9,0), 10% FBS og DMEM (høy glukose) undersøkt ved UV-synlig absorpsjonsspektroskopi på forskjellige tidspunkter.Som vist i tilleggsfigur 9, ble det observert små endringer i RuDA-NP-absorpsjonsbånd i PBS ved pH 7,4/9,0, FBS og DMEM, noe som indikerer utmerket stabilitet av RuDA-NP.Imidlertid ble hydrolyse av malm funnet i et surt medium (рН = 5,4).Vi evaluerte også stabiliteten til RuDA og RuDA-NP ved bruk av høyytelses væskekromatografi (HPLC) metoder.Som vist i tilleggsfigur 10 var RuDA stabil i en blanding av metanol og vann (50/50, v/v) den første timen, og hydrolyse ble observert etter 4 timer.Imidlertid ble bare en bred konkav-konveks topp observert for RuDA NP-er.Derfor ble gelpermeasjonskromatografi (GPC) brukt for å vurdere stabiliteten til RuDA NP-er i PBS (pH = 7,4).Som vist i tilleggsfigur 11, etter 8 timers inkubasjon under de testede forholdene, endret ikke topphøyden, toppbredden og topparealet til NP RuDA seg signifikant, noe som indikerer utmerket stabilitet til NP RuDA.I tillegg viste TEM-bilder at morfologien til RuDA-NP nanopartikler forble praktisk talt uendret etter 24 timer i fortynnet PBS-buffer (pH = 7,4, tilleggsfigur 12).
Fordi selvmontering kan gi malm forskjellige funksjonelle og kjemiske egenskaper, observerte vi frigjøring av 9,10-antracendiylbis(metylen)dimalonsyre (ABDA, indikator 1O2) i metanol-vannblandinger.Malm med forskjellig vanninnhold50.Som vist i figur 2D og tilleggsfigur 13, ble det ikke observert noen nedbrytning av ABDA når vanninnholdet var under 20 %.Med en økning i fuktighet til 40 %, skjedde ABDA-nedbrytning, noe som fremgår av en reduksjon i intensiteten av ABDA-fluorescens.Det har også blitt observert at høyere vanninnhold resulterer i raskere nedbrytning, noe som tyder på at RuDA-selvmontering er nødvendig og fordelaktig for ABDA-nedbrytning.Dette fenomenet er veldig forskjellig fra moderne ACQ (aggregation-induced quenching) kromoforer.Når det bestråles med en laser med en bølgelengde på 808 nm, er kvanteutbyttet av 1O2 RuDA i en blanding av 98 % H2O/2 % DMF 16,4 %, som er 82 ganger høyere enn for ICG (ΦΔ = 0,2 %)51, demonstrerer en bemerkelsesverdig generasjonseffektivitet 1O2 RuDA i tilstanden av aggregering.
Elektronspinn ved bruk av 2,2,6,6-tetrametyl-4-piperidinon (TEMP) og 5,5-dimetyl-1-pyrrolin N-oksid (DMPO) som spinnfeller Resonansspektroskopi (ESR) ble brukt for å identifisere de resulterende artene AFK.av RuDA.Som vist i tilleggsfigur 14 er det bekreftet at 1O2 genereres ved bestrålingstider mellom 0 og 4 minutter.I tillegg, når RuDA ble inkubert med DMPO under bestråling, ble et typisk fire-linjers EPR-signal på 1:2:2:1 DMPO-OH·addukt påvist, noe som indikerer dannelsen av hydroksylradikaler (OH·).Samlet sett viser resultatene ovenfor RuDAs evne til å stimulere ROS-produksjon gjennom en dobbel type I/II fotosensibiliseringsprosess.
For bedre å forstå de elektroniske egenskapene til RuDA i monomere og aggregerte former, ble grensemolekylorbitalene til RuDA i monomere og dimere former beregnet ved hjelp av DFT-metoden.Som vist i fig.3A, er den høyeste okkuperte molekylære orbital (HOMO) av monomer RuDA delokalisert langs ligandryggraden og den laveste uokkuperte molekylorbital (LUMO) er sentrert på TDP-akseptorenheten.Tvert imot er elektrontettheten i den dimere HOMO konsentrert om liganden til ett RuDA-molekyl, mens elektrontettheten i LUMO hovedsakelig er konsentrert om akseptorenheten til et annet RuDA-molekyl, noe som indikerer at RuDA er i dimeren.Funksjoner av CT.
A HOMO og LUMO av malm beregnes i monomere og dimere former.B Singlett- og triplettenerginivåer av malm i monomerer og dimerer.C Estimerte nivåer av RuDA og mulige ISC-kanaler som monomere C og dimere D. Piler indikerer mulige ISC-kanaler.
Fordelingen av elektroner og hull i de lavenergi-singlet-eksiterte tilstandene til RuDA i monomere og dimere former ble analysert ved hjelp av Multiwfn 3.852.53-programvaren, som ble beregnet ved hjelp av TD-DFT-metoden.Som angitt på tilleggsetiketten.Som vist i figur 1-2 er monomere RDA-hull for det meste delokalisert langs ligand-ryggraden i disse singlett-eksiterte tilstander, mens elektroner stort sett er lokalisert i TDP-gruppen, noe som viser de intramolekylære egenskapene til CT.I tillegg, for disse singlett-eksiterte tilstandene, er det mer eller mindre overlapping mellom hull og elektroner, noe som tyder på at disse singlet-eksiterte tilstandene gir noe bidrag fra lokal eksitasjon (LE).For dimerer, i tillegg til intramolekylære CT- og LE-funksjoner, ble en viss andel intermolekylære CT-egenskaper observert i de respektive tilstandene, spesielt S3, S4, S7 og S8, basert på intermolekylær CT-analyse, med CT intermolekylære overganger som de viktigste. (Tilleggstabell).3).
For bedre å forstå de eksperimentelle resultatene, utforsket vi ytterligere egenskapene til RuDA-eksiterte tilstander for å utforske forskjellene mellom monomerer og dimerer (tilleggstabeller 4–5).Som vist i figur 3B er energinivåene til singlett- og tripletteksiterte tilstander til dimeren mye tettere enn monomeren, noe som bidrar til å redusere energigapet mellom S1 og Tn. Det har blitt rapportert at ISC-overgangene kan realiseres innenfor et lite energigap (ΔES1-Tn < 0,3 eV) mellom S1 og Tn54. Det er rapportert at ISC-overgangene kan realiseres innenfor et lite energigap (ΔES1-Tn < 0,3 eV) mellom S1 og Tn54. Сообщалось, что переходы ISC могут быть реализованы в пределах небольшой энергетической щели щели (ΔES1-жn. ДES1-жn. Det er rapportert at ISC-overganger kan realiseres innenfor et lite energigap (ΔES1-Tn <0,3 eV) mellom S1 og Tn54.据报道，ISC 跃迁可以在S1 和Tn54 之间的小能隙（ΔES1-Tn < 0.3 eV）内实现。据报道，ISC 跃迁可以在S1 和Tn54 之间的小能隙（ΔES1-Tn < 0.3 eV）内实现。 Сообщалось, что переход ISC может быть реализован в пределах небольшой энергетической щели (ΔДES1,3Tn.4n.4n.3n. Det er rapportert at ISC-overgangen kan realiseres innenfor et lite energigap (ΔES1-Tn < 0,3 eV) mellom S1 og Tn54.I tillegg må bare en orbital, okkupert eller ubesatt, avvike i bundne singlett- og tripletttilstander for å gi et SOC-integral som ikke er null.Derfor, basert på analysen av eksitasjonsenergien og orbitalovergangen, er alle mulige kanaler for ISC-overgangen vist i fig.3C,D.Spesielt er bare én ISC-kanal tilgjengelig i monomeren, mens den dimere formen har fire ISC-kanaler som kan forbedre ISC-overgangen.Derfor er det rimelig å anta at jo flere RuDA-molekyler som er aggregert, jo mer tilgjengelige vil ISC-kanalene være.Derfor kan RuDA-aggregater danne to-bånds elektroniske strukturer i singlett- og tripletttilstandene, og redusere energigapet mellom S1 og tilgjengelig Tn, og dermed øke effektiviteten til ISC for å lette generering av 1O2.
For ytterligere å belyse den underliggende mekanismen, syntetiserte vi en referanseforbindelse av aren-Ru(II)-komplekset (RuET) ved å erstatte to etylgrupper med to trifenylamin-fenylgrupper i RuDA (fig. 4A, for fullstendig karakterisering, se ESI, tillegg 15 -21 ) Fra donor (dietylamin) til akseptor (TDF) har RuET de samme intramolekylære CT-karakteristikkene som RuDA.Som forventet viste absorpsjonsspekteret til RuET i DMF et lavenergi-ladningsoverføringsbånd med sterk absorpsjon i det nære infrarøde området i området 600–1100 nm (fig. 4B).I tillegg ble RuET-aggregering også observert med økende vanninnhold, noe som ble reflektert i rødforskyvningen av absorpsjonsmaksimumet, noe som ble ytterligere bekreftet av flytende AFM-avbildning (Supplerende Fig. 22).Resultatene viser at RuET, i likhet med RuDA, kan danne intramolekylære tilstander og selvmontere til aggregerte strukturer.
Kjemisk struktur av RuET.B Absorpsjonsspektra av RuET i blandinger av forskjellige forhold mellom DMF og vann.Tomter C EIS Nyquist for RuDA og RuET.Fotostrømresponser D av RuDA og RuET under påvirkning av laserstråling med en bølgelengde på 808 nm.
Fotonedbrytningen av ABDA i nærvær av RuET ble evaluert ved bestråling med en laser med en bølgelengde på 808 nm.Overraskende nok ble det ikke observert noen nedbrytning av ABDA i forskjellige vannfraksjoner (tilleggsfigur 23).En mulig årsak er at RuET ikke effektivt kan danne en båndet elektronisk struktur fordi etylkjeden ikke fremmer effektiv intermolekylær ladningsoverføring.Derfor ble elektrokjemisk impedansspektroskopi (EIS) og forbigående fotostrømmålinger utført for å sammenligne de fotoelektrokjemiske egenskapene til RuDA og RuET.I følge Nyquist-plottet (Figur 4C) viser RuDA en mye mindre radius enn RuET, noe som betyr at RuDA56 har raskere intermolekylær elektrontransport og bedre konduktivitet.I tillegg er fotostrømtettheten til RuDA mye høyere enn for RuET (fig. 4D), noe som bekrefter den bedre ladningsoverføringseffektiviteten til RuDA57.Dermed spiller fenylgruppen til trifenylamin i malm en viktig rolle i å gi intermolekylær ladningsoverføring og dannelse av en båndet elektronisk struktur.
For å øke tumorakkumulering og in vivo biokompatibilitet, kapslet vi RuDA videre med F127.Den gjennomsnittlige hydrodynamiske diameteren til RuDA-NPs ble bestemt til å være 123,1 nm med en smal fordeling (PDI = 0,089) ved bruk av den dynamiske lysspredningsmetoden (DLS) (Figur 5A), som fremmet tumorakkumulering ved å øke permeabilitet og retensjon.EPR) effekt.TEM-bildene viste at Ore NP-er har en jevn sfærisk form med en gjennomsnittlig diameter på 86 nm.Spesielt opptrådte absorpsjonsmaksimumet til RuDA-NPer ved 800 nm (tilleggsfigur 24), noe som indikerer at RuDA-NPer kan beholde funksjonene og egenskapene til selvmonterende RuDAer.Det beregnede ROS kvanteutbyttet for NP Ore er 15,9 %, som er sammenlignbart med Ore.De fototermiske egenskapene til RuDA NPer ble studert under påvirkning av laserstråling med en bølgelengde på 808 nm ved bruk av et infrarødt kamera.Som vist i fig.5B,C opplevde kontrollgruppen (kun PBS) en svak temperaturøkning, mens temperaturen på RuDA-NPs-løsningen økte raskt med økende temperatur (ΔT) til 15,5, 26,1 og 43,0°C.Høye konsentrasjoner var henholdsvis 25, 50 og 100 µM, noe som indikerer en sterk fototermisk effekt av RuDA NP-er.I tillegg ble målinger av oppvarming/avkjølingssyklus tatt for å evaluere den fototermiske stabiliteten til RuDA-NP og sammenligne med ICG.Temperaturen på malm-NP-er falt ikke etter fem oppvarmings-/avkjølingssykluser (fig. 5D), noe som indikerer den utmerkede fototermiske stabiliteten til malm-NP-er.I kontrast viser ICG lavere fototermisk stabilitet sett fra den tilsynelatende forsvinningen av det fototermiske temperaturplatået under de samme forholdene.I henhold til den forrige metoden58 ble den fototermiske konverteringseffektiviteten (PCE) til RuDA-NP beregnet til 24,2 %, som er høyere enn eksisterende fototermiske materialer som gullnanorods (21,0 %) og gullnanoskall (13,0 %)59.Dermed viser NP Ore utmerkede fototermiske egenskaper, noe som gjør dem til lovende PTT-midler.
Analyse av DLS- og TEM-bilder av RuDA NP-er (innsatt).B Termiske bilder av ulike konsentrasjoner av RuDA NP-er utsatt for laserstråling ved en bølgelengde på 808 nm (0,5 W cm-2).C Fototermiske konverteringskurver for ulike konsentrasjoner av malm-NP-er, som er kvantitative data.B. D Temperaturøkning av ORE NP og ICG over 5 varme- og kjølesykluser.
Fotocytotoksisitet av RuDA NP-er mot MDA-MB-231 humane brystkreftceller ble evaluert in vitro.Som vist i fig.6A, B, RuDA-NPs og RuDA viste ubetydelig cytotoksisitet i fravær av bestråling, noe som antyder lavere mørk toksisitet av RuDA-NPs og RuDA.Etter eksponering for laserstråling ved en bølgelengde på 808 nm viste imidlertid RuDA og RuDA NP sterk fotocytotoksisitet mot MDA-MB-231 kreftceller med IC50-verdier (halvmaksimum hemmende konsentrasjon) på henholdsvis 5,4 og 9,4 μM, noe som demonstrerer at RuDA-NP og RuDA har potensial for kreftfototerapi.I tillegg ble fotocytotoksisiteten til RuDA-NP og RuDA videre undersøkt i nærvær av vitamin C (Vc), en ROS-oppfanger, for å belyse rollen til ROS i lysindusert cytotoksisitet.Åpenbart økte cellelevedyktigheten etter tilsetning av Vc, og IC50-verdiene til RuDA- og RuDA-NP-er var henholdsvis 25,7 og 40,0 μM, noe som beviser den viktige rollen til ROS i fotocytotoksisiteten til RuDA- og RuDA-NP-er.Lysindusert cytotoksisitet av RuDA-NPer og RuDA i MDA-MB-231 kreftceller ved farging av levende/døde celler ved bruk av calcein AM (grønn fluorescens for levende celler) og propidiumjodid (PI, rød fluorescens for døde celler).bekreftet av celler) som fluorescerende prober.Som vist i figur 6C, forble celler behandlet med RuDA-NP eller RuDA levedyktige uten bestråling, som bevist av intens grønn fluorescens.Tvert imot, under laserbestråling ble det bare observert rød fluorescens, noe som bekrefter den effektive fotocytotoksisiteten til RuDA eller RuDA NP.Det er bemerkelsesverdig at grønn fluorescens dukket opp ved tilsetning av Vc, noe som indikerer et brudd på fotocytotoksisiteten til RuDA og RuDA NP.Disse resultatene stemmer overens med in vitro fotocytotoksisitetsanalyser.
Doseavhengig levedyktighet av A RuDA- og B RuDA-NP-celler i MDA-MB-231-celler i henholdsvis nærvær eller fravær av Vc (0,5 mM).Feilstreker, gjennomsnitt ± standardavvik (n = 3). Uparede, tosidige t-tester *p < 0,05, **p < 0,01 og ***p < 0,001. Uparede, tosidige t-tester *p < 0,05, **p < 0,01 og ***p < 0,001. Непарные двусторонние t-критерии *p <0,05, **p <0,01 og ***p <0,001. Uparede to-halede t-tester *p<0,05, **p<0,01 og ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001. Непарные двусторонние t-тесты *p <0,05, **p <0,01 og ***p <0,001. Uparede to-halede t-tester *p<0,05, **p<0,01 og ***p<0,001.C Fargeanalyse av levende/døde celler ved bruk av calcein AM og propidiumjodid som fluorescerende prober.Målestokk: 30 µm.Representative bilder av tre biologiske gjentakelser fra hver gruppe vises.D Konfokale fluorescensbilder av ROS-produksjon i MDA-MB-231-celler under forskjellige behandlingsforhold.Grønn DCF-fluorescens indikerer tilstedeværelsen av ROS.Bestråle med en laser med en bølgelengde på 808 nm med en effekt på 0,5 W/cm2 i 10 minutter (300 J/cm2).Målestokk: 30 µm.Representative bilder av tre biologiske gjentakelser fra hver gruppe vises.E Flowcytometri RuDA-NPs (50 µM) eller RuDA (50 µM) behandlingsanalyse med eller uten 808 nm laser (0,5 W cm-2) i nærvær og fravær av Vc (0,5 mM) i 10 min.Representative bilder av tre biologiske gjentakelser fra hver gruppe vises.F Nrf-2, HSP70 og HO-1 av MDA-MB-231-celler behandlet med RuDA-NPs (50 µM) med eller uten 808 nm laserbestråling (0,5 W cm-2, 10 min, 300 J cm-2), celler uttrykker 2).Representative bilder av to biologiske gjentakelser fra hver gruppe vises.
Intracellulær ROS-produksjon i MDA-MB-231-celler ble undersøkt ved bruk av 2,7-diklordihydrofluoresceindiacetat (DCFH-DA)-fargemetoden.Som vist i fig.6D viste celler behandlet med RuDA-NPs eller RuDA distinkt grønn fluorescens når de ble bestrålt med 808 nm laser, noe som indikerer at RuDA-NPs og RuDA har en effektiv evne til å generere ROS.Tvert imot, i fravær av lys eller i nærvær av Vc, ble bare et svakt fluorescerende signal fra cellene observert, noe som indikerte en liten dannelse av ROS.Intracellulære ROS-nivåer i RuDA-NP-celler og RuDA-behandlede MDA-MB-231-celler ble videre bestemt ved flowcytometri.Som vist i tilleggsfigur 25, ble den gjennomsnittlige fluorescensintensiteten (MFI) generert av RuDA-NPs og RuDA under 808 nm laserbestråling betydelig økt med henholdsvis omtrent 5,1 og 4,8 ganger sammenlignet med kontrollgruppen, noe som bekrefter deres utmerkede dannelse av AFK.kapasitet.Imidlertid var intracellulære ROS-nivåer i RuDA-NP- eller MDA-MB-231-celler behandlet med RuDA bare sammenlignbare med kontroller uten laserbestråling eller i nærvær av Vc, lik resultatene av konfokal fluorescensanalyse.
Det er vist at mitokondrier er hovedmålet for Ru(II)-arenkomplekser60.Derfor ble den subcellulære lokaliseringen av RuDA og RuDA-NPs undersøkt.Som vist i tilleggsfigur 26 viser RuDA og RuDA-NP lignende cellulære distribusjonsprofiler med høyest akkumulering i mitokondrier (henholdsvis 62,5 ± 4,3 og 60,4 ± 3,6 ng/mg protein).Imidlertid ble bare en liten mengde Ru funnet i kjernefysiske fraksjoner av Ore og NP Ore (henholdsvis 3,5 og 2,1%).Den gjenværende cellefraksjonen inneholdt gjenværende ruthenium: 31,7 % (30,6 ± 3,4 ng/mg protein) for RuDA og 42,9 % (47,2 ± 4,5 ng/mg protein) for RuDA-NPs.Generelt akkumuleres malm og NP malm hovedsakelig i mitokondrier.For å vurdere mitokondriell dysfunksjon brukte vi JC-1 og MitoSOX Red-farging for å vurdere henholdsvis mitokondriell membranpotensial og superoksidproduksjonskapasitet.Som vist i tilleggsfigur 27, ble intens grønn (JC-1) og rød (MitoSOX Red) fluorescens observert i celler behandlet med både RuDA og RuDA-NPs under 808 nm laserbestråling, noe som indikerer at både RuDA og RuDA-NPs er svært fluorescerende Det kan effektivt indusere mitokondriell membrandepolarisering og superoksidproduksjon.I tillegg ble mekanismen for celledød bestemt ved bruk av flowcytometribasert analyse av annexin V-FITC/propidiumjodid (PI).Som vist i figur 6E, når de ble bestrålt med 808 nm laser, induserte RuDA og RuDA-NP en betydelig økt tidlig apoptoserate (nedre høyre kvadrant) i MDA-MB-231-celler sammenlignet med PBS eller PBS pluss laser.behandlede celler.Når Vc ble tilsatt, sank imidlertid apoptosehastigheten til RuDA og RuDA-NP betydelig fra 50,9 % og 52,0 % til henholdsvis 15,8 % og 17,8 %, noe som bekrefter den viktige rollen til ROS i fotocytotoksisiteten til RuDA og RuDA-NP..I tillegg ble lette nekrotiske celler observert i alle testede grupper (øvre venstre kvadrant), noe som tyder på at apoptose kan være den dominerende formen for celledød indusert av RuDA og RuDA-NPs.
Siden skade på oksidativt stress er en viktig determinant for apoptose, ble den nukleære faktoren assosiert med erytroid 2, faktor 2 (Nrf2) 62, en nøkkelregulator for antioksidantsystemet, undersøkt i RuDA-NPs-behandlet MDA-MB-231.Virkningsmekanisme for RuDA NP-er indusert av bestråling.Samtidig ble ekspresjon av nedstrømsproteinet hem oksygenase 1 (HO-1) også påvist.Som vist i figur 6F og tilleggsfigur 29, økte RuDA-NP-mediert fototerapi Nrf2- og HO-1-ekspresjonsnivåer sammenlignet med PBS-gruppen, noe som indikerer at RuDA-NP-er kan stimulere signalveier for oksidativt stress.I tillegg, for å studere den fototermiske effekten av RuDA-NPs63, ble uttrykket av varmesjokkproteinet Hsp70 også evaluert.Det er klart at celler behandlet med RuDA-NPs + 808 nm laserbestråling viste økt ekspresjon av Hsp70 sammenlignet med de to andre gruppene, noe som gjenspeiler en cellulær respons på hypertermi.
De bemerkelsesverdige in vitro-resultatene fikk oss til å undersøke in vivo-ytelsen til RuDA-NP i nakne mus med MDA-MB-231-svulster.Vevsfordelingen av RuDA NP-er ble studert ved å bestemme innholdet av ruthenium i lever, hjerte, milt, nyrer, lunger og svulster.Som vist i fig.7A viste det maksimale innholdet av malm-NP-er i normale organer ved første observasjonstidspunkt (4 timer), mens maksimalt innhold ble bestemt i tumorvev 8 timer etter injeksjon, muligens på grunn av malm-NP-er.EPR-effekt av LF.I henhold til distribusjonsresultatene ble den optimale varigheten av behandling med NP-malm tatt 8 timer etter administrering.For å illustrere prosessen med akkumulering av RuDA-NP-er på tumorsteder, ble de fotoakustiske (PA) egenskapene til RuDA-NP-er overvåket ved å registrere PA-signalene til RuDA-NP-er på forskjellige tidspunkter etter injeksjon.Først ble PA-signalet til RuDA-NP in vivo vurdert ved å ta opp PA-bilder av et tumorsted etter intratumoral injeksjon av RuDA-NP.Som vist i tilleggsfigur 30, viste RuDA-NP-er et sterkt PA-signal, og det var en positiv korrelasjon mellom RuDA-NP-konsentrasjon og PA-signalintensitet (tilleggsfigur 30A).Deretter ble in vivo PA-bilder av tumorsteder registrert etter intravenøs injeksjon av RuDA og RuDA-NP på forskjellige tidspunkter etter injeksjon.Som vist i figur 7B, økte PA-signalet til RuDA-NP fra tumorstedet gradvis med tiden og nådde et platå 8 timer etter injeksjon, i samsvar med vevsfordelingsresultater bestemt ved ICP-MS-analyse.Med hensyn til RuDA (Supplerende Fig. 30B), dukket den maksimale PA-signalintensiteten opp 4 timer etter injeksjon, noe som indikerer en rask inntrengningshastighet for RuDA i svulsten.I tillegg ble utskillelsesadferden til RuDA og RuDA-NPs undersøkt ved å bestemme mengden ruthenium i urin og avføring ved bruk av ICP-MS.Hovedveien for eliminering for RuDA (Supplerende Fig. 31) og RuDA-NPs (Fig. 7C) er via feces, og effektiv clearance av RuDA og RuDA-NPs ble observert i løpet av den 8-dagers studieperioden, noe som betyr at RuDA og RuDA-NPer kan effektivt elimineres fra kroppen uten langvarig toksisitet.
A. Ex vivo distribusjon av RuDA-NP i musevev ble bestemt av Ru-innholdet (prosentandel av administrert dose av Ru (ID) per gram vev) på forskjellige tidspunkter etter injeksjon.Data er gjennomsnitt ± standardavvik (n = 3). Uparede, tosidige t-tester *p < 0,05, **p < 0,01 og ***p < 0,001. Uparede, tosidige t-tester *p < 0,05, **p < 0,01 og ***p < 0,001. Непарные двусторонние t-критерии *p <0,05, **p <0,01 og ***p <0,001. Uparede to-halede t-tester *p<0,05, **p<0,01 og ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001. Непарные двусторонние t-тесты *p <0,05, **p <0,01 og ***p <0,001. Uparede to-halede t-tester *p<0,05, **p<0,01 og ***p<0,001.B PA-bilder av in vivo tumorsteder ved 808 nm eksitasjon etter intravenøs administrering av RuDA-NPs (10 µmol kg-1) på forskjellige tidspunkter.Etter intravenøs administrering av RuDA NP-er (10 µmol kg-1), ble C Ru skilt ut fra mus med urin og feces ved forskjellige tidsintervaller.Data er gjennomsnitt ± standardavvik (n = 3).
Oppvarmingskapasiteten til RuDA-NP in vivo ble studert i nakne mus med MDA-MB-231 og RuDA-svulster for sammenligning.Som vist i fig.8A og tilleggsfig. 32 viste kontrollgruppen (saltvann) mindre temperaturendringer (ΔT ≈ 3 °C) etter 10 minutter med kontinuerlig eksponering.Imidlertid økte temperaturen til RuDA-NPs og RuDA raskt med maksimale temperaturer på henholdsvis 55,2 og 49,9 °C, noe som ga tilstrekkelig hypertermi for in vivo kreftbehandling.Den observerte økningen i høy temperatur for RuDA NP-er (ΔT ≈ 24°C) sammenlignet med RuDA (ΔT ≈ 19°C) kan skyldes dens bedre permeabilitet og akkumulering i tumorvev på grunn av EPR-effekten.
Infrarøde termiske bilder av mus med MDA-MB-231-svulster bestrålt med 808 nm laser til forskjellige tider 8 timer etter injeksjon.Representative bilder av fire biologiske gjentakelser fra hver gruppe vises.B Relativt tumorvolum og C Gjennomsnittlig tumormasse for ulike grupper av mus under behandling.D Kurver av kroppsvekter for ulike grupper av mus.Bestråle med en laser med en bølgelengde på 808 nm med en effekt på 0,5 W/cm2 i 10 minutter (300 J/cm2).Feilstreker, gjennomsnitt ± standardavvik (n = 3). Uparede, tosidige t-tester *p < 0,05, **p < 0,01 og ***p < 0,001. Uparede, tosidige t-tester *p < 0,05, **p < 0,01 og ***p < 0,001. Непарные двусторонние t-критерии *p <0,05, **p <0,01 og ***p <0,001. Uparede to-halede t-tester *p<0,05, **p<0,01 og ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001. Непарные двусторонние t-тесты *p <0,05, **p <0,01 og ***p <0,001. Uparede to-halede t-tester *p<0,05, **p<0,01 og ***p<0,001. E H&E-fargebilder av større organer og svulster fra forskjellige behandlingsgrupper, inkludert saltvann, saltvann + laser, RuDA, RuDA + Laser, RuDA-NPs og RuDA-NPs + lasergrupper. E H&E-fargebilder av større organer og svulster fra forskjellige behandlingsgrupper, inkludert saltvann, saltvann + laser, RuDA, RuDA + Laser, RuDA-NPs og RuDA-NPs + lasergrupper. Изображения окрашивания E H&E основных органов и опухолей из разных групп лечения, включая группы физиологического раствора, физиологического раствора + лазера, RuDA, RuDA + Laser, RuDA-NPs и RuDA-NPs + Laser. E H&E-fargebilder av større organer og svulster fra forskjellige behandlingsgrupper, inkludert saltvann, saltvann + laser, RuDA, RuDA + Laser, RuDA-NPs og RuDA-NPs + Lasergrupper.°来自不同治疗组的主要器官和肿瘤的E H&E Окрашивание E H&E основных органов и опухолей из различных групп лечения, включая физиологический раствор, физиологический раствор + лазер, RuDA, RuDA + лазер, RuDA-NPs и RuDA-NPs + лазер. E H&E-farging av større organer og svulster fra ulike behandlingsgrupper inkludert saltvann, saltvann + laser, RuDA, RuDA + laser, RuDA-NPs og RuDA-NPs + laser.Målestokk: 60 µm.
Effekten av fototerapi in vivo med RuDA- og RuDA-NP-er ble evaluert der nakne mus med MDA-MB-231-svulster ble injisert intravenøst ​​med RuDA- eller RuDA-NP-er i en enkeltdose på 10,0 µmol kg-1 via halevenen, og deretter 8 timer etter injeksjon.laserbestråling med en bølgelengde på 808 nm.Som vist i figur 8B ble tumorvolumene betydelig økt i saltvanns- og lasergruppene, noe som indikerer at saltvann eller laser 808-bestråling hadde liten effekt på tumorvekst.Som i saltvannsgruppen ble rask tumorvekst også observert hos mus behandlet med RuDA-NPs eller RuDA i fravær av laserbestråling, noe som viser deres lave mørketoksisitet.I kontrast, etter laserbestråling, induserte både RuDA-NP og RuDA-behandling signifikant tumorregresjon med tumorvolumreduksjoner på henholdsvis 95,2 % og 84,3 % sammenlignet med den saltvannsbehandlede gruppen, noe som indikerer utmerket synergistisk PDT., mediert av RuDA/CHTV-effekten.– NP eller malm Sammenlignet med RuDA viste RuDA NP en bedre fototerapeutisk effekt, som hovedsakelig skyldtes EPR-effekten til RuDA NP.Tumorvekstinhiberingsresultater ble videre vurdert ved tumorvekt fjernet på dag 15 av behandling (fig. 8C og tilleggsfig. 33).Gjennomsnittlig tumormasse i RuDA-NP-behandlede mus og RuDA-behandlede mus var henholdsvis 0,08 og 0,27 g, som var mye lettere enn i kontrollgruppen (1,43 g).
I tillegg ble kroppsvekten til mus registrert hver tredje dag for å studere mørketoksisiteten til RuDA-NP eller RuDA in vivo.Som vist i figur 8D ble ingen signifikante forskjeller i kroppsvekt observert for alle behandlingsgrupper. Videre ble hematoxylin og eosin (H&E) farging av hovedorganene (hjerte, lever, milt, lunge og nyre) fra forskjellige behandlingsgrupper utført. Videre ble hematoxylin og eosin (H&E)-farging av hovedorganene (hjerte, lever, milt, lunge og nyre) fra forskjellige behandlingsgrupper utført. Кроме того, было проведено окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) основных органов (сердца, печени, печени, печени, печени, печени I tillegg ble det utført hematoxylin og eosin (H&E) farging av hovedorganer (hjerte, lever, milt, lunger og nyrer) fra forskjellige behandlingsgrupper.此外，对不同治疗组的主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）亊夒缌脏）进眨缌脏 (HAN) Кроме того, проводили окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) основных органов (сердца, печенки, селечном селечном I tillegg ble hematoxylin og eosin (H&E) farging av hovedorganer (hjerte, lever, milt, lunge og nyre) utført i forskjellige behandlingsgrupper.Som vist i fig.8E, H&E-fargebildene av fem hovedorganer fra RuDA-NPs og RuDA-gruppene viser ingen åpenbare abnormiteter eller organskader. 8E, H&E-fargebildene av fem hovedorganer fra RuDA-NPs og RuDA-gruppene viser ingen åpenbare abnormiteter eller organskader.Som vist i fig.8E, изображения окрашивания H&E gir основных органов из групп RuDA-NPs og RuDA nе демонстрируют явных органовигов аноилигов. 8E, H&E-fargebilder av fem hovedorganer fra RuDA-NPs og RuDA-gruppene viser ingen åpenbare organabnormiteter eller lesjoner.如图8E 所示，来自RuDA-NPs 和RuDA 组的五个主要器官的H&E 染色图像没有显的像没有显的夺庂如图8E 所示，来自RuDA-NPs 和RuDA 组的五个主要器官的H&E Hva er tilgjengelig på рисунке 8E, изображения окрашивания H&E leverer основных органов из групп RuDA-NPs og RuDA не покаванил. Som vist i figur 8E, viste H&E-fargingsbilder av de fem hovedorganene fra RuDA-NPs og RuDA-gruppene ingen åpenbare abnormiteter eller organskade.Disse resultatene viste at verken RuDA-NP eller RuDA viste tegn på toksisitet in vivo. Dessuten viste H&E-fargingsbilder av svulster at både RuDA + Laser og RuDA-NPs + Laser-gruppene kunne forårsake alvorlig kreftcelleødeleggelse, noe som demonstrerte den utmerkede in vivo fototerapeutiske effekten av RuDA og RuDA-NPs. Dessuten viste H&E-fargingsbilder av svulster at både RuDA + Laser og RuDA-NPs + Laser-gruppene kunne forårsake alvorlig kreftcelleødeleggelse, noe som demonstrerte den utmerkede in vivo fototerapeutiske effekten av RuDA og RuDA-NPs.I tillegg viste hematoxylin-eosin-fargede tumorbilder at både RuDA+Laser- og RuDA-NPs+Laser-grupper kan indusere alvorlig ødeleggelse av kreftceller, noe som viser den overlegne fototerapeutiske effekten av RuDA og RuDA-NPs in vivo.此外，肿瘤的H&E 染色图像显示，RuDA + Laser 和RuDA-NPs + Laser 组均可导致严重的癌细胞破坏，证明了RuDA 和RuDA-NPs 的优异的体内光疗功效。此外 ， 肿瘤 的 & e 染色 显示 ， ruda + laser 和 ruda-nps + laser 组均 导致 的 癌细胞 破坏 ， 证明 了 ruda 和 ruda-nps 的 的 体内 光疗。。。。。。。。。。。。。 .. . .I tillegg viste hematoxylin- og eosinfargede tumorbilder at både RuDA+Laser- og RuDA-NPs+Laser-grupper resulterte i alvorlig ødeleggelse av kreftceller, noe som viste overlegen fototerapeutisk effekt av RuDA og RuDA-NPs in vivo.
Avslutningsvis ble Ru(II)-aren (RuDA) organometallisk kompleks med DA-type ligander designet for å lette ISC-prosessen ved å bruke aggregeringsmetoden.Syntetisert RuDA kan selvmonteres gjennom ikke-kovalente interaksjoner for å danne RuDA-avledede supramolekylære systemer, og dermed lette 1O2-dannelse og effektiv fototermisk konvertering for lysindusert kreftterapi.Det er bemerkelsesverdig at monomer RuDA ikke genererte 1O2 under laserbestråling ved 808 nm, men kunne generere en stor mengde 1O2 i aggregert tilstand, noe som demonstrerer rasjonaliteten og effektiviteten til designet vårt.Påfølgende studier har vist at den supramolekylære sammenstillingen gir RuDA forbedrede fotofysiske og fotokjemiske egenskaper, som rødforskyvningsabsorpsjon og fotoblekingsmotstand, som er svært ønskelig for PDT- og PTT-behandling.Både in vitro og in vivo eksperimenter har vist at RuDA NP med god biokompatibilitet og god akkumulering i svulsten viser utmerket lysindusert antikreftaktivitet ved laserbestråling ved en bølgelengde på 808 nm.Dermed vil RuDA NP-er som effektive bimodale supramolekylære PDT/PTW-reagenser berike settet med fotosensibilisatorer aktivert ved bølgelengder over 800 nm.Den konseptuelle utformingen av det supramolekylære systemet gir en effektiv rute for NIR-aktiverte fotosensibilisatorer med utmerkede fotosensibiliserende effekter.
Alle kjemikalier og løsemidler ble hentet fra kommersielle leverandører og brukt uten ytterligere rensing.RuCl3 ble kjøpt fra Boren Precious Metals Co., Ltd. (Kunming, Kina).[(η6-p-cym)Ru(fendio)Cl]Cl (fendio = 1,10-fenantrolin-5,6-dion) og 4,7-bis[4-(N,N-difenylamino)fenyl]-5 ,6-Diamino-2,1,3-benzotiadiazol ble syntetisert i henhold til tidligere studier64,65.NMR-spektra ble registrert på et Bruker Avance III-HD 600 MHz spektrometer ved Southeastern University Analytical Test Center ved bruk av d6-DMSO eller CDCl3 som løsningsmiddel.Kjemiske skift δ er gitt i ppm.med hensyn til tetrametylsilan, og interaksjonskonstantene J er gitt i absolutte verdier i hertz.Høyoppløselig massespektrometri (HRMS) ble utført på et Agilent 6224 ESI/TOF MS-instrument.Elementæranalyse av C, H og N ble utført på en Vario MICROCHNOS elementær analysator (Elementar).UV-synlige spektre ble målt på et Shimadzu UV3600 spektrofotometer.Fluorescensspektre ble registrert på et Shimadzu RF-6000 spektrofluorimeter.EPR-spektra ble registrert på et Bruker EMXmicro-6/1 instrument.Morfologien og strukturen til de forberedte prøvene ble studert på FEI Tecnai G20 (TEM) og Bruker Icon (AFM) instrumenter som opererer ved en spenning på 200 kV.Dynamisk lysspredning (DLS) ble utført på en Nanobrook Omni-analysator (Brookhaven).Fotoelektrokjemiske egenskaper ble målt på et elektrokjemisk oppsett (CHI-660, Kina).Fotoakustiske bilder ble tatt med FUJIFILM VisualSonics Vevo® LAZR-systemet.Konfokale bilder ble tatt med et Olympus FV3000 konfokalmikroskop.FACS-analyse ble utført på et BD Calibur flowcytometer.Høyytelses væskekromatografi (HPLC)-eksperimenter ble utført på et Waters Alliance e2695-system ved bruk av en 2489 UV/Vis-detektor.Gelpermeasjonskromatografi (GPC)-tester ble registrert på et Thermo ULTIMATE 3000-instrument ved bruk av en ERC RefratoMax520-brytningsindeksdetektor.
[(η6-p-cym)Ru(fendio)Cl]Cl (fendio = 1,10-fenantrolin-5,6-dion)64 (481,0 mg, 1,0 mmol), 4,7-bis[4-(N, N-difenylamino)fenyl]-5,6-diamino-2,1,3-benzotiadiazol 65 (652,0 mg, 1,0 mmol) og iseddik (30 ml) ble omrørt ved tilbakeløpskjøleskap i 12 timer.Løsningsmidlet ble deretter fjernet i vakuum ved bruk av en rotasjonsfordamper.Det resulterende residuet ble renset ved flash-kolonnekromatografi (silikagel, CH2Cl2:MeOH=20:1) for å oppnå RuDA som et grønt pulver (utbytte: 877,5 mg, 80%).anus.Beregnet for C64H48Cl2N8RuS: C 67,84, H 4,27, N 9,89.Funnet: C 67,92, H 4,26, N 9,82.1H NMR (600 MHz, d6-DMSO) 5 10,04 (s, 2H), 8,98 (s, 2H), 8,15 (s, 2H), 7,79 (s, 4H), 7,44 (s, 8H), 7,21 (d, J = 31,2 Hz, 16H), 6,47 (s, 2H), 6,24 (s, 2H), 2,69 (s, 1H), 2,25 (s, 3H), 0,99 (s, 6H).13C NMR (150 MHz, D6-DMSO), Δ (ppm) 158,03, 152,81, 149,31, 147,98, 147,16, 139,98, 136,30,16,16,16,16,16,16,16,36,16,16,16,16,16,36,36,36,34,34,34,34,34,34,34, 136,34,36,34,36,34,12,34,12, 130,16,16,16,16,16,16,16,16,16,16,16,,16,,16,16,,16,,16,,16,,16, 128,16,16,16,,16, 128,16,16, 130, 130,16,16,16,16,16,16,12,12,12,,10 dollar. , 103. , 86.52, 84.75, 63.29, 30.90, 22.29, 18.83.ESI-MS: m/z [M-Cl]+ = 1097,25.
Syntese av 4,7-bis[4-(N,N-dietylamino)fenyl-5,6-diamino-2,1,3-benzotiadiazol (L2): L2 ble syntetisert i to trinn.Pd(PPh3)4 (46 mg, 0,040 mmol) ble tilsatt til N,N-dietyl-4-(tributylstannyl)anilin (1,05 g, 2,4 mmol) og 4,7-dibrom-5,6-dinitroløsning - 2, 1,3-benzotiadiazol (0,38 g, 1,0 mmol) i tørr toluen (100 ml).Blandingen ble omrørt ved 100°C i 24 timer.Etter fjerning av toluen i vakuum ble det resulterende faste stoffet vasket med petroleumseter.Deretter ble en blanding av denne forbindelsen (234,0 mg, 0,45 mmol) og jernpulver (0,30 g, 5,4 mmol) i eddiksyre (20 ml) omrørt ved 80°C i 4 timer.Reaksjonsblandingen ble helt i vann og det resulterende brune faste stoffet ble samlet ved filtrering.Produktet ble renset to ganger ved vakuumsublimering for å gi et grønt fast stoff (126,2 mg, 57 % utbytte).anus.Beregnet for C26H32N6S: C 67,79, H 7,00, N 18,24.Funnet: C 67,84, H 6,95, H 18,16.1H NMR (600 MHz, CDC13), 8 (ppm) 7,42 (d, 4H), 6,84 (d, 4H), 4,09 (s, 4H), 3,42 (d, 8H), 1,22 (s, 12H).13C NMR (150 MHz, CDC13), 8 (ppm) 151,77, 147,39, 138,07, 131,20, 121,09, 113,84, 111,90, 44,34, 12,77.ESI-MS: m/z [M+H]+ = 461,24.
Forbindelser ble fremstilt og renset etter prosedyrer tilsvarende RuDA.anus.Beregnet for C48H48Cl2N8RuS: C 61,27, H 5,14, N 11,91.Funnet: C, 61,32, H, 5,12, N, 11,81, 1H NMR (600 MHz, d6-DMSO), 5 (ppm) 10,19 (s, 2H), 9,28 (s, 2H), 8,09 (s, 2H), 7,95 (s, 4H), 6,93 (s, 4H), 6,48 (d, 2H), 6,34 (s, 2H), 3,54 (t, 8H), 2,80 (m, 1H), 2,33 (s, 3H), 1,31 (t, 12H), 1,07 (s, 6H).13C NMR (151 MHz, CDCL3), Δ (ppm) 158,20, 153,36, 148,82, 148,14, 138,59, 136,,87,7,7,7,7,7,7,7,7,7.., 38.06, 31.22, 29.69, 22.29, 19.19, 14.98, 12.93.ESI-MS: m/z [M-Cl]+ = 905,24.
RuDA ble oppløst i MeOH/H2O (5/95, v/v) i en konsentrasjon på 10 μM.Absorpsjonsspekteret til RuDA ble målt hvert 5. minutt på et Shimadzu UV-3600 spektrofotometer under bestråling med laserlys med en bølgelengde på 808 nm (0,5 W/cm2).ICG-spektrene ble registrert under de samme forholdene som standarden.
EPR-spektrene ble registrert på et Bruker EMXmicro-6/1-spektrometer med en mikrobølgeeffekt på 20 mW, et skanningsområde på 100 G og en feltmodulasjon på 1 G. 2,2,6,6-tetrametyl-4-piperidon (TEMP) og 5,5-dimetyl-1-pyrrolin N-oksid (DMPO) ble brukt som spinnfeller.Elektronspinnresonansspektra ble registrert for blandede løsninger av RuDA (50 µM) og TEMF (20 mM) eller DMPO (20 mM) under påvirkning av laserstråling med en bølgelengde på 808 nm (0,5 W/cm2).
DFT- og TD-DFT-beregninger for RuDA ble utført ved PBE1PBE/6–31 G*//LanL2DZ-nivåer i vandig løsning ved bruk av Gauss-programmet 1666,67,68.HOMO-LUMO-, hull- og elektronfordelingene til den lavenergi-singlet-eksiterte tilstanden RuDA ble plottet ved bruk av GaussView-programmet (versjon 5.0).
Vi prøvde først å måle generasjonseffektiviteten til 1O2 RuDA ved bruk av konvensjonell UV-synlig spektroskopi med ICG (ΦΔ = 0,002) som standard, men fotonedbrytningen av ICG påvirket resultatene sterkt.Kvanteutbyttet av 1O2 RuDA ble således målt ved å detektere en endring i intensiteten til ABDA-fluorescens ved omtrent 428 nm når det ble bestrålt med en laser med en bølgelengde på 808 nm (0,5 W/cm2).Eksperimenter ble utført på RuDA og RuDA NPer (20 μM) i vann/DMF (98/2, v/v) inneholdende ABDA (50 μM).Kvanteutbyttet av 1O2 ble beregnet ved å bruke følgende formel: ΦΔ (PS) = ΦΔ (ICG) × (rFS/APS)/(rICG/AICG).rPS og rICG er reaksjonshastighetene til ABDA med 1O2 hentet fra henholdsvis fotosensibilisatoren og ICG.APS og AICG er absorbansen til fotosensibilisatoren og ICG ved henholdsvis 808 nm.
AFM-målinger ble utført i væskeforhold ved bruk av skannemodus på et Bruker Dimension Icon AFM-system.Ved bruk av en åpen struktur med flytende celler ble cellene vasket to ganger med etanol og tørket med en strøm av nitrogen.Sett de tørkede cellene inn i det optiske hodet på mikroskopet.Plasser umiddelbart en dråpe av prøven i væskebassenget og plasser den på utkragingen med en steril engangsplastsprøyte og en steril nål.En annen dråpe plasseres direkte på prøven, og når det optiske hodet senkes, går de to dråpene sammen og danner en menisk mellom prøven og væskereservoaret.AFM-målinger ble utført ved bruk av en SCANASYST-FLUID V-formet nitridutkrager (Bruker, hardhet k = 0,7 N m-1, f0 = 120–180 kHz).
HPLC-kromatogrammer ble oppnådd på et Waters e2695-system utstyrt med en phoenix C18-kolonne (250×4,6 mm, 5 µm) ved bruk av en 2489 UV/Vis-detektor.Bølgelengden til detektoren er 650 nm.Mobilfase A og B var henholdsvis vann og metanol, og strømningshastigheten for mobilfase var 1,0 ml·min-1.Gradienten (løsningsmiddel B) var som følger: 100 % fra 0 til 4 minutter, 100 % til 50 % fra 5 til 30 minutter, og tilbakestilt til 100 % fra 31 til 40 minutter.Malm ble oppløst i en blandet løsning av metanol og vann (50/50, etter volum) i en konsentrasjon på 50 μM.Injeksjonsvolumet var 20 μl.
GPC-analyser ble registrert på et Thermo ULTIMATE 3000-instrument utstyrt med to PL aquagel-OH MIXED-H kolonner (2×300×7,5 mm, 8 µm) og en ERC RefratoMax520 brytningsindeksdetektor.GPC-kolonnen ble eluert med vann ved en strømningshastighet på 1 ml/min ved 30°C.Malm-NP-er ble oppløst i PBS-løsning (pH = 7,4, 50 μM), injeksjonsvolumet var 20 μL.
Fotostrømmer ble målt på et elektrokjemisk oppsett (CHI-660B, Kina).De optoelektroniske responsene når laseren ble slått av og på (808 nm, 0,5 W/cm2) ble målt ved en spenning på 0,5 V i henholdsvis en svart boks.En standard tre-elektrodecelle ble brukt med en L-formet glassaktig karbonelektrode (GCE) som arbeidselektrode, en standard kalomelelektrode (SCE) som referanseelektrode og en platinaskive som motelektrode.En 0,1 M Na2S04-løsning ble brukt som en elektrolytt.
Den humane brystkreftcellelinjen MDA-MB-231 ble kjøpt fra KeyGEN Biotec Co., LTD (Nanjing, Kina, katalognummer: KG033).Celler ble dyrket i monolag i Dulbeccos Modified Eagle's Medium (DMEM, høy glukose) supplert med en løsning av 10 % føtalt bovint serum (FBS), penicillin (100 μg/ml) og streptomycin (100 μg/ml).Alle cellene ble dyrket ved 37°C i en fuktig atmosfære inneholdende 5% CO2.
MTT-analysen ble brukt til å bestemme cytotoksisiteten til RuDA og RuDA-NPs i nærvær og fravær av lysbestråling, med eller uten Vc (0,5 mM).MDA-MB-231 kreftceller ble dyrket i 96-brønners plater ved en celletetthet på ca. 1 x 105 celler/ml/brønn og inkubert i 12 timer ved 37,0°C i en atmosfære av 5 % CO2 og 95 % luft.RuDA og RuDA NP-er oppløst i vann ble tilsatt til cellene.Etter 12 timers inkubering ble cellene eksponert for 0,5 W cm-2 laserstråling ved en bølgelengde på 808 nm i 10 minutter (300 J cm-2) og deretter inkubert i mørket i 24 timer.Cellene ble deretter inkubert med MTT (5 mg/ml) i ytterligere 5 timer.Bytt til slutt mediet til DMSO (200 µl) for å løse opp de resulterende lilla formazankrystallene.OD-verdier ble målt ved hjelp av en mikroplateleser med en bølgelengde på 570/630 nm.IC50-verdien for hver prøve ble beregnet ved bruk av SPSS-programvaren fra dose-responskurver oppnådd fra minst tre uavhengige eksperimenter.
MDA-MB-231-celler ble behandlet med RuDA og RuDA-NP i en konsentrasjon på 50 μM.Etter 12 timers inkubering ble cellene bestrålt med en laser med en bølgelengde på 808 nm og en effekt på 0,5 W/cm2 i 10 minutter (300 J/cm2).I vitamin C (Vc)-gruppen ble cellene behandlet med 0,5 mM Vc før laserbestråling.Cellene ble deretter inkubert i mørket i ytterligere 24 timer, deretter farget med calcein AM og propidiumjodid (20 μg/ml, 5 μl) i 30 minutter, deretter vasket med PBS (10 μl, pH 7,4).bilder av fargede celler.