Takk for at du besøker Nature.com.Nettleserversjonen du bruker har begrenset CSS-støtte.For den beste opplevelsen anbefaler vi at du bruker en oppdatert nettleser (eller deaktiverer kompatibilitetsmodus i Internet Explorer).I mellomtiden, for å sikre fortsatt støtte, vil vi gjengi nettstedet uten stiler og JavaScript.
Kreftceller har utviklet forskjellige mekanismer for å overvinne cellulært stress og fortsette å utvikle seg.Proteinkinase R (PKR) og dens proteinaktivator (PACT) er de første responderne som overvåker ulike stresssignaler som fører til hemming av celleproliferasjon og apoptose.Imidlertid er reguleringen av PACT-PKR-veien i kreftceller stort sett ukjent.Her fant vi at lang ikke-kodende RNA (lncRNA) aspartyl tRNA syntetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) er direkte involvert i inhiberingen av PACT-PKR-banen og fremmer kreftcelleproliferasjon.Ved å bruke storskala funksjonell screening av CRISPRI 971 kreftassosiert lncRNA fant vi at DARS-AS1 var assosiert med betydelig forbedret kreftcelleproliferasjon.Derfor hemmer DARS-AS1 knockout celleproliferasjon og fremmer kreftcelleapoptose i forskjellige kreftcellelinjer in vitro og reduserer tumorvekst betydelig in vivo.Mekanisk binder DARS-AS1 seg direkte til PACT-aktiveringsdomenet og forhindrer PACT-PKR-interaksjon, og reduserer derved PKR-aktivering, eIF2α-fosforylering og hemmer apoptotisk celledød.Klinisk er DARS-AS1 mye uttrykt i flere kreftformer, og overekspresjon av dette lncRNA er en indikasjon på en dårlig prognose.Denne studien belyser kreftspesifikk regulering av PACT-PKR-veien av DARS-AS1 lncRNA og gir et annet mål for kreftprognose og behandling.
Evnen til å tilpasse seg stress er en viktig egenskap for kreftcellers overlevelse og spredning.Den raske spredningen og metabolske kjennetegnene til kreft topper seg i tøffe mikromiljøer - næringsmangel, hypoksi og lav pH - som kan utløse signalveier for celledød.Dysregulering av stresssensitive gener som p535, varmesjokkproteiner 6, 7, KRAS8, 9 og HIF-110, 11, 12, 13 observeres ofte ved kreft, og blokkerer derved apoptose og fremmer overlevelse.
Proteinkinase R (PKR) er en viktig stresssensor og underenhetskinase av eukaryot initieringsfaktor 2α (eIF2α), en translasjonsregulator som kobler cellulært stress til celledød.PKR ble opprinnelig identifisert som et antiviralt protein ved påvisning av et fremmed dobbelttrådet RNA (dsRNA).Ved aktivering fosforylerer PKR eIF2α for å hemme viral og cellulær proteinsyntese14,15,16.PACT (PKR-aktivatorprotein) har blitt identifisert som det første PKR-aktivatorproteinet i fravær av dsRNA17,18,19,20,21,22,23.Gjennom direkte interaksjon med PKR transduserer PACT ulike påkjenninger (serumsulting, peroksid- eller arsenittbehandling) til PKR og nedstrøms signalveier.I tillegg til eIF2α-fosforylering, utløser PACT-mediert PKR-aktivering ulike hendelser assosiert med stressresponsen, inkludert endret redoksstatus via PI3K/Akt24-veien, forbedret DNA-skadekontroll via p5325,26 og NF-κB27,28 Regulerer transkripsjon, 29. Gitt deres kritiske rolle i stressrespons, spredning, apoptose og andre sentrale cellulære prosesser, er PKR og PACT lovende terapeutiske mål for mange sykdommer, spesielt kreft30,31,32,33.Til tross for denne pleiotropiske funksjonelle og biologiske betydningen, forblir reguleringen av PACT/PKR-aktivitet i kreftceller unnvikende.
lncRNA er transkripsjoner større enn 200 nukleotider uten proteinkodende potensial.Siden banebrytende hele genom-sekvenseringsprosjekter har identifisert tusenvis av lncRNA-er, har det blitt gjort mye arbeid for å belyse deres biologiske funksjoner.En voksende mengde forskning har vist at lncRNA er involvert i mange biologiske prosesser37 inkludert regulering av X-kromosominaktivering38,39, imprinting40, transkripsjon41,42, translasjon43 og til og med kreftvekst44,45,46,47.Disse studiene rapporterte at mange lncRNA-er er involvert i PACT/PKR-veien.En slik studie viste at lncRNA ASPACT hemmet PACT-transkripsjon og økte nukleær retensjon av PACT mRNA.Andre studier har vist at lncRNA nc886 binder seg til PKR og hemmer dets fosforylering49,50.Så langt har ikke lncRNA som regulerer PACT-mediert PKR-aktivering blitt rapportert.
Aspartyl-tRNA syntetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) har blitt identifisert som et onkogent lncRNA51,52,53,54.Gjennom reguleringen av miP-194-5p53, miP-12952 og miP-532-3p51 har DARS-AS1 vist seg å fremme veksten av henholdsvis klarcellet nyrecellekarsinom, skjoldbruskkarsinom og ikke-småcellet lungekarsinom.Tong og kolleger fant også at DARS-AS1 fremmer myelomprogresjon ved å opprettholde stabiliteten til protein 39 (RBM39) RNA-bindende motiv.Det er imidlertid ikke utført studier på om dette lncRNA er involvert i reguleringen av PACT-PKR-aktivering og stressresponsen til kreftceller.
Her utførte vi en storskala tap av funksjonsskjerm ved å bruke CRISPRI-systemet og bestemte at DARS-AS1 lncRNA fremmer spredning av flere typer kreftceller.I tillegg har vi identifisert en hovedmekanisme: DARS-AS1 binder seg direkte til PACT, hemmer PACT- og PKR-binding, forhindrer fosforylering av eIF2α, et lavere PKR-substrat, og til slutt hemmer apoptotisk celledød.Avslutningsvis avslører arbeidet vårt DARS-AS1 lncRNA som en regulator av PACT-PKR-veien og et potensielt mål for kreftbehandling og prognose.
Omfattende genomiske profileringsstudier har identifisert hundrevis av lncRNA-er assosiert med kreft.Imidlertid er funksjonen deres stort sett ukjent56.For å identifisere lovende lncRNA-kandidater involvert i kreftprogresjon, utførte vi en tap-av-funksjonsskjerm for redusert spredning i SW620 kolorektal kreftcellelinje ved å bruke CRISPRi-systemet (fig. 1a).Det unike med SW480 og SW620 tykktarmskreftcellelinjene er at de er avledet fra primære og sekundære svulster hos en enkelt pasient.Dette gir en verdifull sammenligning for å studere genetiske endringer i progresjonen av avansert tykktarmskreft.Derfor analyserte vi transkriptomene til kolorektale kreftcellelinjer (SW480 og SW620) ved å bruke RNA-sekvensering og samlet noen potensielle funksjonelle lncRNA-er fra den publiserte litteraturen.Basert på disse resultatene designet vi et samlet sgRNA-bibliotek som inneholder 7355 sgRNA-oligoer rettet mot 971 kreftassosierte lncRNA-er og 500 ikke-målrettede sgRNA-oligoer for en negativ kontroll (tilleggsdata 1).
Skjematisk fremstilling av screening ved bruk av CRISPRi-systemet.b sgRNA anrikning etter screening.Den horisontale stiplede linjen representerer log2 (foldendring) = ±0,58.Den vertikale stiplede linjen indikerer p-verdi = 0,05.Svarte prikker representerer ikke-mål sgRNA (utpekt som NC).Røde prikker er sgRNA-er rettet mot DARS-AS1.Blå prikker er sgRNA-er rettet mot LINC00205, et tidligere beskrevet onkogent lncRNA.fold endring = (normalisert avlesning, dag 17)/(normalisert avlesning, dag 0).c DARS-AS1 sgRNA knockdown hemmet cellevekst.Feilstolper representerer ± standardavvik for de tre eksperimentene.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 tosidig Students t-test.d DARS-AS1 uttrykk i svulster (TCGA datasett).em Uttrykk av DARS-AS1 i parede normale prøver og tumorprøver fra pasienter med henholdsvis BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP og COAD (TCGA-datasett).p-verdier ble oppnådd ved å bruke paret to-hale Students t-test.
Etter å ha konstruert plasmidet og pakket lentiviruset, transduserte vi dCas9-SW620 kolorektal kreftcellelinje med biblioteket ovenfor i fire uavhengige infeksjonsforsøk.Multiplisiteten av infeksjon (MOI) for disse infeksjonene var 0,1–0,3, noe som indikerer at hver celle bare kan transfekteres med ett sgRNA.Etter 18 dager med in vitro-kultur ble anrikningsprofilen til mål-sgRNA-er redusert eller økt etter screening, mens antallet ikke-målrettede kontrolloligonukleotider forble relativt uendret sammenlignet med pre-screeningsprofilen, noe som indikerer at målet vårt har en svært screen-spesifikk bibliotek.Ris.1b og tilleggstabell 1). LINC00205, som tidligere ble rapportert å fremme lungekreft og leverkreftprogresjon58,59,60, ble screenet ut (log2 (foldendring) <-0,58, p-verdi <0,05), noe som bekrefter påliteligheten til denne screeningen (fig. 1b). LINC00205, som tidligere ble rapportert å fremme lungekreft og leverkreftprogresjon58,59,60, ble screenet ut (log2 (foldendring) <-0,58, p-verdi <0,05), noe som bekrefter påliteligheten til denne screeningen (fig. 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис 1b). LINC00205, tidligere rapportert å fremme progresjon av lungekreft og leverkreft58,59,60, ble ekskludert (log2 (fold endring) <-0,58, p-verdi <0,05), noe som bekrefter robustheten til denne screeningen (fig. 1b) . LINC00205 之前被报道可促进肺癌和肝癌进展58,59,60，被筛选掉（log2（倍数变化）< -0.58，p 值< 0.05），证实了该筛选的可靠性（图1b）。 LINC00205 之前被报道可促进肺癌和肝癌进展58,59,60，被筛选掉（log2（倍数变化）< -0.58，p 值< 0.05），证实了该筛选的可靠性（图1b）。 LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис 1b). LINC00205, tidligere rapportert å fremme progresjon av lunge- og leverkreft58,59,60, ble ekskludert (log2 (fold endring) <-0,58, p-verdi <0,05), noe som bekrefter robustheten til denne screeningen (fig. 1b).
Blant alle lncRNA-er som ble testet, ble DARS-AS1 også screenet, med de tre beslektede sgRNA-oligonukleotidene betydelig redusert etter 18 dagers kultur, noe som tyder på at knockdown av dette lncRNAet resulterte i redusert kreftproliferasjon (fig. 1b).Dette resultatet ble ytterligere støttet av MTS-analyse i kolorektale kreftceller som viste at veksthastigheten til DARS-AS1 knockdown-celler bare ble halvert sammenlignet med kontrollceller (Figur 1c) og var i samsvar med tidligere rapporter om flere andre krefttyper.: klarcellet nyrekreft, skjoldbruskkjertelkreft og ikke-småcellet lungekreft51,52,53,55.Imidlertid forblir dens funksjon og molekylære mekanismer i kolorektal kreft uutforsket.Derfor valgte vi dette lncRNA for videre studier.
For å studere DARS-AS1-ekspresjon hos pasienter, analyserte vi omfattende 10 327 tumorprøver fra Cancer Genome Atlas (TCGA)-prosjektet.Resultatene våre viser at DARS-AS1 er vidt uttrykt og betydelig oppregulert i friske celler i en rekke svulster, inkludert tykktarmsadenokarsinom (COAD), renalt klarcellet karsinom (KIRC) og nyrepapillærcellekarsinom (KIRP)..Svært få (fig. 1d og tilleggsfig. 1a, b). Analyse av sammenkoblede friske/tumorprøver bekreftet videre et betydelig høyere uttrykk av DARS-AS1 i svulster av blære urotelial karsinom (BLCA), nyre renal clear cell carcinoma (KIRC), prostata adenokarsinom (PRAD), lunge plateepitelkarsinom (LUSC) , livmor corpus endometriekarsinom (UCEC), lungeadenokarsinom (LUAD), lever hepatocellulært karsinom (LIHC), nyrepapillært cellekarsinom (KIRP) og tykktarmsadenokarsinom (COAD) (p verdi < 0,05) (fig. 1e–m) . Analyse av sammenkoblede friske/tumorprøver bekreftet videre et betydelig høyere uttrykk av DARS-AS1 i svulster av blære urotelial karsinom (BLCA), nyre renal clear cell carcinoma (KIRC), prostata adenokarsinom (PRAD), lunge plateepitelkarsinom (LUSC) , livmor corpus endometriekarsinom (UCEC), lungeadenokarsinom (LUAD), lever hepatocellulært karsinom (LIHC), nyrepapillært cellekarsinom (KIRP) og tykktarmsadenokarsinom (COAD) (p verdi < 0,05) (fig. 1e–m) .Analyse av sammenkoblede friske/tumorprøver bekreftet også signifikant høyere ekspresjon av DARS-AS1 i blære urotelialt karsinom (BLCA), klarcellet nyre- og nyrecellekarsinom (KIRC), prostataadenokarsinom (PRAD), lungeplateepitelkarsinom (LUSC)., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– m) . , endometriekarsinom i corpus uteri (UCEC), adenokarsinom i lungen (LUAD), hepatocellulært leverkarsinom (LIHC), papillærcellekarsinom i nyrene (KIRP) og adenokarsinom i tykktarmen (COAD) (p verdi < 0,05) (Fig. 1e– m) .配对健康/肿瘤样本的分析进一步证实了DARS-AS1 在膀胱尿路上皮癌(BLCA)、肾肾透明细胞癌(KIRC)、前列腺腺癌(PRAD)、肺鳞状细胞癌(LUSC) 肿瘤中的显着更高表达，子宫体子宫内膜癌（UCEC），肺腺癌（LUAD），肝肝细胞癌（LIHC），肾肾乳头状细胞癌（KIRP）和结肠腺癌（COAD）（p值<0,05）（图1e-m） .配 对 健康/肿瘤样本 的 分析 证实 了 dars-os1 在 尿路 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 、 、 肾 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 前列 腺腺癌 腺腺癌 (Prad) 、 细胞癌 细胞癌(lusc) 肿瘤 的 的 的 的 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中显着 更 高 表达 ， 内膜 癌 （（ucel） 肺腺癌 （luad） 肝肝 细胞癌 （lihc） 肾 肾 乳头状 细胞癌 （kirp） （coad） （p 值<0.05）（图1e-m） .Analyse av friske/tumorparede prøver støttet videre rollen til DARS-AS1 i blære urotelial karsinom (BLCA), klarcellet nyrecellekarsinom (KIRC), prostata adenokarsinom (PRAD) og lunge plateepitelkarsinom (LUSC) svulster.экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -m). uttrykk i corpus uterint karsinom (UCEC), lungeadenokarsinom (LUAD), hepatocellulært karsinom (LIHC), nyrepapillærcellekarsinom (KIRP) og kolonadenokarsinom (COAD) (p verdi <0,05) (Figur 1e -m).Til sammen indikerer disse resultatene at DARS-AS1 er bredt og sterkt uttrykt i en rekke kreftformer.
Fordi DARS-AS1 og DARS (genet som koder for antisense-tråden) deler samme promoter og er plassert ved siden av hverandre, designet vi shRNA for spesifikt å slå ned DARS-AS1, men ikke DARS (tilleggsfigur 2a,b og tilleggstabell 2). .I tillegg til SW620, brukte vi også tre andre cellelinjer som sterkt uttrykker DARS-AS1 for å studere effektiviteten og funksjonen til shRNA knockdown (tilleggstabell 3).Resultatene våre indikerte at alle de tre shRNA-ene som ble utviklet oppnådde minst 80 % DARS-AS1 knockdown-effektivitet med liten effekt på mengden DARS mRNA (tilleggsfigur 2c-f).I tillegg fant vi at DARS-AS1 knockdown med disse shRNA-ene signifikant hemmet cellevekst i kolorektale kreftcellelinjer SW620 (49,7%) og HCT116 (27,7%), brystkreftcellelinje MBA-MD-231 (53,4%).) og HepG2-hepatomcellelinjen (92,7 % reduksjon), så vel som deres evne til å danne uforankrede kuler (gjennomsnittlig reduksjon på ~50,8 %, 44,6 %, 40,7 % og 75,7 % per cellelinje) (fig. 2a,b).I SW620 bekreftet resultatene av kolonidannelsesanalysen videre at DARS-AS1 shRNA signifikant hemmet celleproliferasjon med en gjennomsnittlig reduksjon på ca. 69,6 % (fig. 2c).
Effekt av kontroll shRNA og DARS-AS1 shRNA på celleproliferasjon (a) og sfæroiddannelse (b) i SW620, HCT116, MBA-MD-231 og HepG2 celler.c Effekt av kontroll shRNA og DARS-AS1 shRNA på kolonidannelse i SW620 celler.Celleproliferasjon (d), sfæroiddannelse (e) og kolonidannelse (f) av SW620-celler som overuttrykker DARS-AS1.Data vist er gjennomsnitt ± standardavvik for tre eksperimenter.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 og *** p ≤ 0,001 ved tosidet Students t-test.
For å komplementere studier med tap av funksjon, opprettet vi deretter SW620-celler som overuttrykker DARS-AS1 (tilleggsfig. 2g).DARS-AS1-overuttrykk økte signifikant cellevekst (1,8 ganger), uforankret sfæroiddannelse (1,4 ganger) og kolonidannelse (3,3 ganger) i SW620-celler (fig. 2d–f).Vi bekreftet dette resultatet ved å bruke en annen DARS-AS1-uttrykkende cellelinje, A549.Denne økte celleproliferasjonen på grunn av DARS-AS1-overekspresjon ble videre observert i A549-celler (tilleggsfigur 2h, i og tilleggstabell 3).Til sammen viser disse gevinst- og tapsstudiene at DARS-AS1 fremmer kreftcelleproliferasjon in vitro.
For å utforske den underliggende mekanismen som DARS-AS1 regulerer celleproliferasjon med, utførte vi en RNA-nedtrekksanalyse for å identifisere dens potensielle proteinbindende partnere.RT-qPCR-resultater viste at omtrent 86,2 % av DARS-AS1 er lokalisert i cytoplasmaet til SW620-celler (Supplerende Fig. 3a).Det in vitro transkriberte biotinylerte DARS-AS1 eller pseudoRNA ble deretter inkubert med SW620-cellelysater etterfulgt av SDS-PAGE-separasjon.Påfølgende sølvfarging viste at et distinkt bånd (~38 kDa) ble betydelig beriket i DARS-AS1 pull-prøver, men ikke i dummy-RNA eller perleprøver (fig. 3a).Dette båndet ble identifisert som et PKR-aktiverende protein (PACT) ved massespektrometri (MS) og ytterligere bekreftet ved immunoblotting i SW620-, HCT116- og HepG2-cellelinjer (fig. 3a,b).Anrikningen av DARS og relaterte PACT-proteiner - PKR og TRBP - ble også undersøkt ved bruk av RNA-analyse ved Western blotting (WB).Resultatene indikerte at ingen direkte interaksjon mellom DARS-AS1 RNA og disse tre proteinene ble funnet (Supplerende Fig. 3b).Den spesifikke interaksjonen mellom DARS-AS1 og PACT ble ytterligere bekreftet av RNA-immunutfellingsanalyse (RIP), som viste at DARS-AS1 var betydelig beriket i anti-PACT-antistoffer, men ikke andre kontroll-RNA (figur 3c).For å bestemme om DARS-AS1 interagerer direkte med PACT i fravær av andre cellulære komponenter, ble en in vitro biolagsinterferometri (BLI)-analyse utført ved bruk av renset PACT.Biotin-merket DARS-AS1 eller dummy RNA ble immobilisert på streptavidin (SA) biosensorer og deretter inkubert i kinetisk buffer inneholdende 1 μM PACT.Spesielt bandt PACT sterkt til DARS-AS1 (KD-verdi ~26,9 nM), men ikke for å etterligne RNA (figur 3d).Til sammen viser disse resultatene en direkte interaksjon og høy affinitet mellom DARS-AS1 og PACT.
RNA pull-analyse identifiserte DARS-AS1 som interagerte med PACT i SW620-celler.Ovenfor sølvfarging av relaterte proteiner.Lavere immunoblots ble utført med anti-PACT-antistoff.b RNA pull-down analyse ble utført i HCT116 (øverst) og HepG2 (nederst) celler.PACT-anrikning ble påvist ved immunblotting.cRNA-immunutfellingsanalyser (RIP) ble utført i SW620-celler ved å bruke de angitte antistoffene.d PACT-bindingskurver til DARS-AS1 eller kontroll-RNA i full lengde ble oppnådd ved bruk av biolagsinterferometri (BLI).RNA ble immobilisert på en streptavidin biosensor.1 μM PACT ble brukt for å måle assosiasjon.RNA pull-analysen ble utført ved bruk av biotinylert DARS-AS1 i full lengde eller avkortet (øverst).Immunoblot som viser PACT mottatt (nederst).f Renset flagget PACT ble inkubert med biotinylert DARS-AS1 i full lengde eller avkortet (som i e) for in vitro RIP-analyse.Det ekstraherte RNA ble verifisert ved RT-qPCR.g Den relative affiniteten til forskjellige RNA-fragmenter for PACT ble oppnådd ved bruk av biolagsinterferometri.For analyse ble 100 nM RNA og 1 μM RAST brukt.h In vitro RIP-analyser ble utført ved bruk av renset intakt eller trunkert merket PACT.Det ekstraherte RNA ble verifisert ved RT-qPCR.i Veksthastighet for SW620-celler som overuttrykker DARS-AS1, PACT eller begge deler.j Overekspresjon av full-lengde eller trunkert DARS-AS1 i SW620-celler hadde forskjellige effekter på cellevekst.k Apoptose ble påvist ved immunblotting med anti-PARP-antistoff.l Knockout av DARS-AS1 induserer apoptose av SW620-celler som vist ved flowcytometri.Data vist er gjennomsnitt ± standardavvik for tre eksperimenter. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, ved tosidig Students t-test. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, ved tosidig Students t-test. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 ved tosidet Students t-test. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 ved tosidet Students t-test.
Vi genererte deretter tre biotinylerte DARS-AS1 RNA-fragmenter ved in vitro-transkripsjon for å identifisere DARS-AS1-regionen som kreves for PACT-assosiasjon (figur 3e).RNA-analyseresultatene viste at hvert fragment var i stand til å interagere med PACT, men den 3'-terminale regionen (384–768 nukleotider merket A3) viste mer enn 1–384 nukleotider merket A1) (fig. 3e).Lignende resultater ble observert i in vitro RIP-analysen ved bruk av rekombinant PACT (figur 3f).I samsvar med disse resultatene viste eksperimenter for å binde immobiliserte RNA-fragmenter til PACT ved bruk av BLI også at PACT har en høyere affinitet for A3 (384–768 nt) (KD-verdi på omtrent 94,6 nM), mens nesten ingen koblinger med andre områder.(Fig. 3d).
Vi undersøkte også de tilknyttede bindingsregionene i PACT.PACT inneholder tre funksjonelle domener, hvorav to er konserverte dobbelttrådete RNA-bindende domener (dsRBD) og et tredje domene (betegnet D3) som fungerer som en aktivator av proteininteraksjoner.For å undersøke lncRNA-bindingskapasiteten til hvert domene, konstruerte vi tre mutasjoner som fjernet hvert av de tre domenene og utførte en in vitro RIP-analyse.Resultatene våre viste at sletting av det tredje domenet (D3) av PACT signifikant reduserte interaksjonen med DARS-AS1 (med 0,11 ganger sammenlignet med intakt PACT) sammenlignet med de to andre mutasjonene (fig. 3h), det ble vist at frigjøringen av D3 samhandlet med DARS.-AC1.Til sammen antyder disse resultatene at interaksjon mellom DARS-AS1 og PACT primært kan skje gjennom 3'-enden av DARS-AS1 og D3-domenet til PACT.
Vi bemerket at DARS-AS1 ikke hadde noen effekt på PACT-uttrykk og PACT hadde ingen effekt på DARS-AS1 (tilleggsfigur 3c).Vi undersøkte deretter effekten av PACT knockdown på cellevekst.I motsetning til DARS-AS1, vokste relative celler 1,5–3 ganger raskere når PACT ble slått ned (tilleggsfig. 3d).Resultatene av kolonidannelsesanalysen indikerte at cellene dannet 2-3 ganger kolonier etter shRNA-behandling med PACT (Supplerende Fig. 3e).For å teste om DARS-AS1 regulerer celleproliferasjon gjennom PACT, genererte vi SW620-celler som overuttrykker PACT, DARS-AS1 eller begge deler.Overekspresjon av PACT viste signifikant hemming av celleproliferasjon (figur 3i).Mens DARS-AS1-overuttrykk i seg selv fremmet celleproliferasjon betydelig, var det ingen signifikant forskjell i veksthastigheten til celler som overuttrykker DARS-AS1 og PACT.Disse resultatene tyder på at PACT kan motvirke den økte spredningen forårsaket av DARS-AS1-overuttrykk.
Siden forskjellige regioner av DARS-AS1 har forskjellige PACT-bindende evner, undersøkte vi deres relative innflytelse på celleproliferasjon ved forskjellig overekspresjon av DARS-AS1-fragmenter.Sammenlignet med de to andre fragmentene ble DARS-AS1 overuttrykt i 3'-enden (384–768 nt), den viktigste PACT-relaterte regionen i DARS-AS1, som hadde den høyeste evnen til å stimulere celleproliferasjon (fig. 3j).Disse resultatene indikerer en positiv korrelasjon mellom bindingskapasiteten og den biologiske funksjonen til DARS-AS1.
PACT har blitt rapportert å være et pro-apoptotisk protein19.Derfor undersøkte vi effekten av DARS-AS1 på apoptose.Som forventet økte DARS-AS1 knockdown betydelig PARP-spalting i SW620-celler og økte andelen anneksin V-positive celler i SW620, HCT116, HepG2 og MBA-MD-231 cellelinjer (fig. 3k).3).3f–h), noe som indikerer at den anti-apoptotiske effekten av DARS-AS1 i kreftceller er motsatt av den apoptose-induserende funksjonen til PACT.Til sammen antyder disse resultatene at mekanismen til DARS-AS1 onkogen funksjon kan være gjennom hemming av PACT-funksjonen.
Deretter utforsket vi de funksjonelle implikasjonene av DARS-AS1-PACT-foreningen.PACT har blitt rapportert å aktivere PKR gjennom direkte interaksjon, som deretter forbedrer eIF2α-fosforylering, og forårsaker translasjonssletting og apoptose17.Først undersøkte vi om DARS-AS1 påvirker den cellulære lokaliseringen av PACT og PKR.Konfokal fluorescensmikroskopi viste at PACT og PKR var sterkt kolokalisert i SW620-celler med en gjennomsnittlig Pearson-korrelasjonskoeffisient på 0,72.I mellomtiden reduserte DARS-AS1-overuttrykk signifikant PACT- og PKR-samlokalisering (gjennomsnittlig Pearson-korrelasjonskoeffisient 0,61) (Figur 4a).For å undersøke om DARS-AS1 kunne modulere PACT-PKR-interaksjonen, utførte vi en co-immunopresipitasjonsanalyse (co-IP) med anti-PACT-antistoff i SW620-cellelysater.PKR var sterkt beriket i anti-PACT i kontrollceller, mens PKR-gjenvinning ble betydelig redusert i lysater fra celler som overuttrykker DARS-AS1 (fig. 4b).Renset merket PACT og PKR ble brukt for in vitro proteinbindingsanalyser.Følgelig viste de som ga DARS-AS1, men ingen kontroll-RNA, undertrykt PACT-PKR-interaksjon (figur 4c).Alle resultatene viste at DARS-AS1 forstyrret PACT- og PKR-kommunikasjonen.
en samlokalisering av PACT og PKR i kontrollceller eller celler som overuttrykker DARS-AS1 ble observert ved bruk av konfokal fluorescensmikroskopi.Kjernene ble farget med DAPI.Statistiske resultater ble oppnådd fra 16 fotografier.b Samimmunutfelling (co-IP) ved bruk av anti-PACT-antistoff i cellelysater av kontroll SW620-celler eller celler som overuttrykker DARS-AS1.c Merket PACT, renset PKR og transkribert in vitro med DARS-AS1 eller falsk RNA ble inkubert for in vitro proteinbindingsanalyse.Anti-flagg-antistoffer ble brukt til immunutfelling.d Immunoblots med de angitte antistoffene ble utført i SW620- og HCT116-celler transfektert med kontroll-shRNA eller DARS-AS1-shRNA etterfulgt av serumsulting.e DARS-AS1 ekspresjonsnivåer endret cellulær følsomhet for thapsigargin.SW620-celler ble transfektert med DARS-AS1 shRNA, DARS-AS1 overekspresjonsplasmid eller kontrollplasmid.Celler ble behandlet med thapsigargin i 48 timer og cellelevedyktighet ble bestemt ved å bruke MTS-reagenset.f In vitro transkribert DARS-AS1 eller dummy RNA og renset PACT ble brukt for in vitro aktiveringsanalyse og immunoblotdeteksjon.g Immunoblots ved bruk av disse antistoffene ble utført på SW620-ctrl-celler (venstre) eller celler som overuttrykker PKR-mutanter (høyre).Disse cellene ble deretter transfektert med kontroll shRNA eller DARS-AS1-shRNA etterfulgt av serum sult.h Flowcytometri viste at inaktivering av mutant PKR kompenserte for DARS-AS1-indusert apoptose i SW620-celler.i Immunoblots med de angitte antistoffene ble utført i SW620 (venstre) eller HCT116 (høyre) celler.Celler transfektert med kontroll shRNA eller DARS-AS1 shRNA er serumfratatt og supplert med 100 nM PKR C16 inhibitor eller DMSO.Målestokk = 5 µm.Data vist er gjennomsnitt ± standardavvik for tre eksperimenter.* p ≤ 0,05 tosidet Students t-test.
Det antas generelt at når PACT interagerer med PKR17, kan PKR-fosforylering ved Thr451 induseres.Resultatene våre indikerte at nivået av PKR-fosforylering var signifikant forhøyet i DARS-AS1-knockdown-celler etter serumsult (fig. 4d og tilleggsfig. 4a).Følgelig fant vi at fosforylering av eIF2α, hoved-PKR-substratet, også ble betydelig økt av DARS-AS1 shRNA (fig. 4d og tilleggsfig. 4a).Thapsigargin er en ER-stressor som får ER til å frigjøre Ca2+.Behandling med thapsigargin har blitt rapportert å indusere uttrykk og aktivering av PACT, som ytterligere interagerer med og aktiverer PKR, noe som fører til apoptose ved å øke eIF2α-fosforylering 18,61.Her brukte vi thapsigargin som en stimulator av PACT/PKR-banen for å undersøke om DARS-AS1 kan hjelpe celler med å overvinne stress ved å hemme PACT/PKR-banen.Vi observerte at nivået av DARS-AS1-ekspresjon korrelerte positivt med celleresistens mot thapsigargin.SW620-celler som overuttrykker DARS-AS1 overlevde bedre når de ble behandlet med thapsigargin, mens celler med DARS-AS1 knockdown ble mer mottakelige (fig. 4e).I samsvar med disse resultatene reduserte DARS-AS1-overekspresjon thapsigargin-indusert PKR-fosforylering (tilleggsfigur 4b).I motsetning, etter thapsigargin-behandling, ble PKR og eIF2α fosforylert i høyere grad i DARS-AS1 knockdown-celler sammenlignet med kontrollceller (tilleggsfigur 4b).Interessant nok induserte thapsigargin DARS-AS1-ekspresjon på en doseavhengig måte, noe som kan indikere en antistressfunksjon til DARS-AS1 (tilleggsfigur 4c).I tillegg utførte vi in vitro aktiveringsanalyser for å bekrefte disse observasjonene.Kort fortalt ble PKR renset fra cellelysater ved å bruke et anti-PKR-antistoff, deretter inkubert med rekombinant PACT og DARS-AS1 transkribert in vitro.Etter den enzymatiske reaksjonen ble fosfo-PKR påvist ved bruk av WB.Resultatene våre indikerte at PKR-fosforylering ble signifikant hemmet av DARS-AS1, men ikke av kontroll-RNA (figur 4f).Disse resultatene in vitro og in vivo tyder på at DARS-AS1 hemmer PACT-mediert PKR-aktivering.Samtidig observerte vi også en nedgang i PACT-utvinning i nærvær av DARS-AS1 (figur 4f).Dette resultatet er i samsvar med resultatene av in vitro proteinbindingsanalysen (figur 4c) og illustrerer igjen blokkeringsfunksjonen til DARS-AS1 for PACT-PKR-assosiasjon.
Ser246 og Ser287 i D3-domenet til PACT er nødvendig for PKR-aktivering under cellulært stress.Substitusjon av to serinrester for alanin ga mutant PACT (mutD), som aktiverte PKR i fravær av stress, og substitusjon for alanin (mutA) reverserte protokollen.Siden vi har demonstrert viktigheten av dette domenet i direkte assosiasjon med DARS-AS1, genererte vi disse to PACT-mutantene for å teste om disse restene også kunne være involvert i interaksjon med DARS-AS1.Interessant nok mistet begge mutantene evnen til å binde seg til DARS-AS1 (tilleggsfigur 4d), noe som tyder på at den fullstendige strukturen til PACT-proteinet kan være nødvendig for effektiv interaksjon med DARS-AS1.
Videre antyder resultatene våre også at DARS-AS1-shRNA-indusert hemming av celleproliferasjon delvis kan gjenopprettes ved å overuttrykke en dominant negativ PACT-mutant (PACTmutA) eller en dominant negativ PKR-mutant (PKRmut) (Supplerende Fig. 4e. e).Overekspresjon av dominant-negative PKR-mutanter reduserte PKR-fosforylering indusert av DARS-AS1-knockdown samt eIF2α-fosforylering i serum-depriverte celler (fig. 4g).Enda viktigere, andelen apoptotiske celler indusert av DARS-AS1 knockdown ble også redusert i celler som overuttrykker PKRmut (fig. 4h og tilleggsfig. 4g).Hemming av PKR-kinaseaktivitet svekker også DARS-AS1-funksjonen, da resultatene viste at DARS-AS1-knockdown sjelden utløste PKR- og eIF2α-fosforylering når cellene ble behandlet med en PKR-spesifikk C16-hemmer (fig. 4i og tilleggsfig. 4h).).Samlet antyder resultatene våre at DARS-AS1 fremmer celleproliferasjon, i det minste delvis, ved å hemme PACT-mediert PKR-aktivering.
For ytterligere å utforske rollen til DARS-AS1 i tumorigenese, utførte vi in vivo-eksperimenter ved å bruke en mus xenograft-modell. Resultatene viser at knockdown av DARS-AS1 dramatisk reduserte tumorveksten hos mus (p-verdi <0,0001) (fig. 5a). Resultatene viser at knockdown av DARS-AS1 dramatisk reduserte tumorveksten hos mus (p-verdi <0,0001) (fig. 5a). Результаты показывают, что нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мышей (nedsatt p <0,0001) (res.). Resultatene viser at DARS-AS1 knockdown drastisk reduserer tumorvekst hos mus (p verdi < 0,0001) (Figur 5a).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0,0001）（囀5a）结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0,0001）（图5a） Результаты показали, что нокдаун DARS-AS1 значительно снижает рост опухоли у мышей (nedsatt р <0,0001) (5). Resultatene viste at DARS-AS1 knockdown signifikant reduserte tumorvekst hos mus (p verdi < 0,0001) (Figur 5a).I DARS-AS1 knockdown-gruppen var det således en signifikant reduksjon i gjennomsnittlig tumorvolum med omtrent 72,9 % og gjennomsnittlig tumormasse med omtrent 87,8 % (figur 5b-d).Disse resultatene tyder sterkt på at DARS-AS1 betydelig kan fremme tumorvekst in vivo.
Effekter av ad DARS-AS1 knockdown på kolorektal onkogenese hos nakne mus.Vekstkurver (a), tumorstørrelse (b), vekt (c) og tumorbilder (d) vises.Feilstreker representerer ±SEM. n = 10. ****p < 0,0001, ved tosidet Students t-test. n = 10. ****p < 0,0001, ved tosidet Students t-test. n = 10. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p < 0,0001 tosidet Students t-test.n = 10. ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验. ****p < 0,0001，通过双尾学生t检验. ****p < 0,0001 for двустороннему критерию Стьюдента. ****p < 0,0001 tosidet Students t-test.e Kaplan-Meier analyserte korrelasjonen mellom DARS-AS1-ekspresjonsnivåer og total overlevelse hos pasienter med UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM og LGG.Høye nivåer av DARS-AS1-ekspresjon hos pasienter var blant de øverste 50 %;det lave nivået av DARS-AS1-ekspresjon hos pasienter var i de nederste 50 %.p-verdier ble bestemt ved hjelp av log rank test.f Foreslått modell der DARS-AS1 regulerer PACT-PKR-veien og tumorvekst.
For bedre å forstå den kliniske effekten av DARS-AS1, undersøkte vi sammenhengen mellom uttrykket og pasientens overlevelse.Ved å analysere TCGA-datasettet fant vi at høyere DARS-AS1-ekspresjon var assosiert med uvealt melanom (UVM), nyrekromofobi (KICH), nyrepapillærcellekarsinom (KIRP), mesotheliom (MESO), multipleks.Lavere overlevelse var signifikant assosiert med glioblastommorfose (GBM) og pasienter med lavgradig hjernegliom (LGG) (figur 5e).Disse resultatene tyder på at DARS-AS1 kan spille en viktig rolle i klinisk tumorprogresjon og kan være en potensiell prediktiv biomarkør i flere kreftformer.
I denne studien, ved bruk av storskala CRISPRI-funksjonell screening, bestemte vi at DARS-AS1 lncRNA overvinner kreftcellestress ved å regulere to viktige stressrespondere, PACT og PKR.Ved å interagere direkte med PACT, hemmet DARS-AS1 PACT-mediert PKR-aktivering, og forhindret derved apoptotisk celledød og fremmet celleproliferasjon (fig. 5f).Oppregulering av DARS-AS1 har blitt observert i flere typer kreft, noe som tyder på at dens funksjon med å fremme kreftcelleoverlevelse under stressende forhold kan være bredt anvendelig for flere typer kreft.
PACT har blitt identifisert som et PKR-aktivatorprotein, og PACT-mediert PKR-aktivering spiller en viktig rolle i stressresponser ved å regulere transkripsjon, translasjon, apoptose og andre viktige cellulære prosesser62.I flere tiår har det blitt gjort forsøk på å forstå den kreftspesifikke reguleringen av PACT-PKR-kaskaden.Her avslørte vår studie en annen mekanisme for regulering av PACT-PKR i kreftceller gjennom cellulært lncRNA DARS-AS1, som binder seg direkte til PACT, blokkerer PACT-PKR-interaksjon, hemmer PKR-aktivering og eIF2α-fosforylering, og dermed hemmer stressindusert apoptose og stimulerer eventuell kreftspredning.celler.Denne oppdagelsen kaster lys over potensielle lncRNA-mål for kreftprognose og terapi.
Dataene våre viste at DARS-AS1 knockdown sensibiliserer celler for serumsult med en betydelig økning i fosforylert PKR og eIF2α.Disse resultatene antyder at DARS-AS1 fremmer kreftcelleoverlevelse under tøffe forhold ved å hemme PACT/PKR-aktivitet.Flere andre ikke-kodende RNA-er, som ASPACT og nc886, er også involvert i PACT/PKR-aksen ved å nedregulere PACT48 mRNA eller regulere autofosforylering ved å binde seg til PKR49,50,64.Blant dem fungerer DARS-AS1 som en disruptor for PACT-PKR-foreningen.Denne studien beriker vår forståelse av PACT/PKR-akseregulering og rollen til lncRNA i stressresponser.
PACT inneholder tre separate domener.Hver av de to første dsRBD-ene er tilstrekkelig til å oppnå høy affinitetsbinding av PACT til PKR, mens det tredje domenet (D3) er nødvendig for PKR-aktivering in vitro og in vivo.Vår studie viste at DARS-AS1 fortrinnsvis samhandler med D3-domenet (fig. 3h).Gitt den store størrelsen på lncRNA (768 nukleotider), kan DARS-AS1-binding til D3 fysisk hemme interaksjonen mellom PACT-domenet til dsRBD og PKR, og dermed blokkere assosiasjonen av PACT og PKR.PACT-punktmutasjoner som erstattet Ser246 og Ser287 i D3 med alanin eller aspartat forstyrret dens bindingsaffinitet for DARS-AS1, og peker på viktigheten av D3s generelle strukturelle og elektriske egenskaper i deres assosiasjon.Ytterligere detaljer om denne mekanismen vil være nødvendig i fremtiden, ved bruk av mer presis biokjemisk analyse og høyoppløselig PACT-strukturanalyse.
Tidligere studier har rapportert at DARS-AS1 fremmer celleproliferasjon gjennom flere mekanismer51,52,53.I ett eksempel observerte etterforskere at DARS-AS1 oppregulerte det antisense-proteinkodende DARS-genet ved å målrette mot miP-194-5p i nyrekreftceller.I denne studien hadde imidlertid DARS-AS1-knockdown liten effekt på DARS-transkripsjon i flere typer kreft, inkludert i det minste kolorektal-, bryst- og leverkreft.Fordi lncRNA-er viser celle- og vevsspesifikke uttrykksmønstre, kan det hende at funksjonelle mekanismer ikke blir bevart på tvers av krefttyper, noe som kan bidra til denne uoverensstemmelsen mellom våre observasjoner og tidligere vurderinger av forskjellige kreftformer.Spesielle studier er nødvendig for å belyse de spesifikke mekanismene til ulike fysiologiske og patologiske prosesser.
En analyse av kliniske data viste at DARS-AS1-ekspresjon i svulster er omvendt korrelert med overlevelsen til kreftpasienter, noe som understreker viktigheten av DARS-AS1/PACT/PKR-aksen i kreftprognose.Avslutningsvis viser vår studie at DARS-AS1 er en regulator av PACT/PKR-signalaksen, fremmer kreftcelleproliferasjon og hemmer apoptose under stressresponsen, noe som gir en annen forskningslinje og er av interesse for fremtidig forskning på potensielle behandlinger .
Humane cellelinjer SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 og HEK293T ble hentet fra National Cell Line Resource Infrastructure i Kina.Alle cellene ble holdt i DMEM-medium (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) supplert med 10 % FBS (Gemini, Brooklyn, NY) og 1 % penicillin-streptomycin (Thermo Fisher Scientific) ved 37°C, 5 % CO2.inkubator.
Anti-PACT, Abcam (ab31967);Anti-PKR, Abcam (ab184257);Anti-PKR (fosfo-T451), Abcam (ab81303);Anti-Flagg, Abcam (ab125243);Anti-eIF2a, Abcam (A0764));anti-eIF2a (fosfor S51), Abcam (ab32157);anti-PACT (fosfor S246), Abgent (AP7744b);anti-ß-tubulin, CST (2128);normal muse-IgG, CST (5415S);normal kanin IgG, CST (2729S).Antistoffer ble fortynnet 1:1000 i PBST for Western blotting og 1:100 for IP.
sgRNA-er ble utviklet ved å bruke et offentlig tilgjengelig verktøy kalt CRISPR-ERA66.Vi brukte standardverktøyparametrene for sgRNA-utvikling og algoritmen beregnede sgRNA-bindingsseter i 3 kb-regionen.sentrert på TSS.Samlinger av sgRNA-oligonukleotider ble syntetisert ved CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) og klonet inn i humaniserte pgRNA-plasmider (Addgene #44248).Totalt 12 µg sammenslått humanisert pgRNA-plasmid, 7,2 µg psPAX2 (Addgene #12260) og 4,8 µg pMD2.G (Addgene #12259) ble kotransfektert inn i 5 x 106 HEK293T-reagens i 106-transeksjonsskåler. celler (CWBIO, Beijing, Kina) etter produsentens instruksjoner.Virusholdige supernatanter ble samlet 48 og 72 timer etter transfeksjon og filtrert gjennom et 0,45 µm filter.For screening ble SW620-celler som uttrykker dCas9/KRAB-fusjonsproteinet oppnådd ved virustransduksjon.Modifiserte SW620-celler ble infisert med virusbiblioteket i fire uavhengige infeksjonsforsøk ved en MOI på 0,1-0,3 og ble tatt prøver med 2 μg/ml puromycin (Sigma, St. Louis, MO) i 2 dager.Deretter ble cellene dyrket i 18 dager in vitro med en minimumsbibliotekdekning på 500 celler/sgRNA for screening.
Genomisk DNA ble ekstrahert i henhold til instruksjonene til QIAamp DNA Blood Midi Kit (QIAGEN, Düsseldorf, Tyskland; 51183).Totalt ble 100 μg genomisk DNA per biologisk gjentakelse brukt til å bygge biblioteket.sgRNA-regionen ble amplifisert ved to runder med PCR og koblet til en strekkode.
PCR-produkter ble renset ved hjelp av NucleoSpin® gel og PCR-rensesett (MACHEREY-NAGEL, Düren, Tyskland; 740609.250) og kvantifisert ved bruk av Qubit™ HS dobbelttrådet DNA-deteksjonssett (Thermo Fisher Scientific; Q32854).
MTS-analysen ble brukt til å måle celleproliferasjon.Celler ble sådd i 96-brønners plater med en initial tetthet på 2000 celler/brønn.Det relative antallet celler ble målt daglig på det angitte tidspunktet i totalt 4-6 dager.For hver brønn ble 20 μl MTS-reagens (Promega) fortynnet med 100 μl DMEM, inkubert med celler i 4 timer ved 37°C, og deretter ble OD490 målt.
Kapasiteten for uforankret vekst ble oppdaget ved å analysere dannelsen av kuler.Kort fortalt ble 2000 celler transfektert med shRNA DARS-AS1 eller kontroll shRNA dyrket i mikroplater med ultralav vedlegg (Corning) med medium endring hver 4. dag.Sfæroidene ble talt etter 14 dager.500 celler transfektert med DARS-AS1-overekspresjonsplasmidet eller et kontrollplasmid ble brukt for forbedringsanalysen, ellers var metoden uendret.
RNA ble transkribert ved bruk av T7 RNA-polymerase og biotin-16-UTP (Roche 1138908910) i henhold til instruksjonene til Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440).Primerne som brukes her er oppført i tilleggstabell 4.
Proteinkodende PACT- eller PKR-regioner ble klonet inn i pET15b (Addgene #73619) og transformert til BL21(DE3).Bakteriene ble inkubert over natten i LB forsynt med ampicillin og deretter fortynnet 100 ganger med fersk LB.Når OD600 til mediet nådde 0,8, ble 1 mM IPTG tilsatt for å indusere proteinekspresjon.Etter inkubering over natten med forsiktig risting (250 rpm ved 20°C), ble cellepelleten samlet ved sentrifugering (4000 rpm, 10 min, 4°C).Resuspender cellepelleten i lyseringsbuffer (50 mM Tris, pH 8,0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) og inkuber på is i 30 minutter, soniker deretter (15 min, 5 s på/av, på is) og sentrifuger (13 000 rpm)., 30 min, 4°C).Supernatanten ble deretter lastet på Ni-NTA-harpiks (QIAGEN) 3 ganger ved 4°C, vasket 4 ganger med vaskebuffer (50 mM Tris, pH 8,0, 40 mM imidazol, 250 mM NaCl) og eluert 3 ganger, med totalt av 10 ml elueringsbuffer (50 mM Tris, pH 8,0, 250 mM NaCl, 300 mM imidazol).Renset protein ble bestemt ved bruk av WB og konsentrasjonen ble bestemt ved bruk av Qubit™-proteinanalysesettet (Thermo Fisher Scientific; Q 33212).
RIP-analyser ble utført som tidligere beskrevet, med modifikasjoner.Kort fortalt lyserer 1x RIP-buffer (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,5 % NP-40, RNasin ribonukleasehemmer (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 mM DDM, protease) cytostatika 1 x 107 cocktail (Roche, 1 mM DTT) og sentrifuger ved 13 000 rpm i 15 minutter ved 4 °C.Supernatanten ble deretter inkubert med protein A+G magnetiske kuler (Millipore) konjugert med 5 μg anti-PACT antistoff (Abeam) eller IgG (CST).Kulene ble vasket 5 ganger med 5x RIP-buffer, deretter fordøyd med proteinase K (NEB).RNA ble ekstrahert med Trizol og bestemt ved RT-qPCR.Primere er presentert i tilleggstabell 5.
In vitro RIP-analysen ble utført i henhold til en modifisert standard RIP-analyseprotokoll.Totalt 5 pmol in vitro transkribert RNA ble fortynnet 1x med RIP-buffer og annealet ved inkubering ved 65°C i 5 minutter etterfulgt av langsom avkjøling til romtemperatur.Totalt 5 pmol intakte eller muterte flaggmerkede PACT-proteiner ble renset fra E. coli.Inkuber med renaturert RNA i 2 timer ved 4 °C og følg prosedyren ovenfor for RIP-analyse for anti-flagg IP.
For RNA-forlengelsesanalyse ble 1x107 celler lysert med 1xRIP buffer.Etter sentrifugering ved 13 000 rpm i 15 minutter ved 4 °C, ble supernatanten forbehandlet med 30 μl streptavidin magnetiske perler (Beckman) i 2 timer ved 4 °C.Det rensede lysatet ble deretter forsynt med gjær-tRNA og inkubert med 40 pmol renaturert RNA over natten ved 4°C, deretter i ytterligere 2 timer og 20 μl nye streptavidin magnetiske perler blokkert med BSA ble tilsatt.Vasketrinnet besto av 4 ganger med 5x RIP-buffer og 4 ganger med 1x RIP-buffer.De tilsvarende proteinene ble eluert med biotin-elueringsbuffer (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 12,5 mM D-biotin, PMSF) og separert på NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen).Etter sølvfarging (Beyotime Biotechnology) ble visse bånd skåret ut og analysert med MS.
Co-IP-analyse ble utført for å teste interaksjonen mellom PACT og PKR.Kort fortalt ble supernatantlysater fremstilt ved å inkubere 1 x 107 lyserte celler i 1 x RIP-buffer etterfulgt av sentrifugering ved 13 000 rpm i 15 minutter ved 4°C.Lysater ble fylt med protein A + G magnetiske kuler, konjugert med 5 µg anti-PACT-antistoff og forsiktig rotert over natten ved 4°C.Kulene ble vasket 3 ganger med 5 x RIP buffer, to ganger med 1 x RIP buffer og eluert med 1 x SDS buffer.Det utvunnede proteinet ble analysert med SDS-PAGE-gel og detektert med WB.
To pmol flagget PACT og 1 pmol PKR ble renset fra E. coli.Fortynn i 1 x RIP-buffer og inkuber med 10 pmol renaturert RNA i 2 timer ved 4 °C.Etter det ble de inkubert med protein A+G magnetisk perlekonjugert anti-merket antistoff i ytterligere to timer.Kulene ble deretter vasket fire ganger med 1x RIP-buffer og eluert med 1x SDS-buffer.Den resulterende PACT og PKR ble oppdaget av WB.
Innleggstid: 23. september 2022
